基因工程第二章載體

基因工程第二章載體第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasmidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征（1）質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。質(zhì)粒的拷貝數(shù)多則50，少則只有一個(gè)。第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（3）質(zhì)粒的不親和性，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存，屬于同一個(gè)不親和群，如pMB1或ColE1的派生質(zhì)粒。已鑒別出25個(gè)以上大腸桿菌質(zhì)粒的不親和群，它們是不相容群體的。（4）質(zhì)粒的分類F質(zhì)粒，或叫致育質(zhì)粒，僅攜帶轉(zhuǎn)移基因，特征：促進(jìn)質(zhì)粒間的有性結(jié)合。R質(zhì)粒，或叫耐藥性質(zhì)粒，能賦予宿主細(xì)胞耐藥性，特征：耐藥性。Ti質(zhì)粒,根瘤農(nóng)桿菌中的毒性質(zhì)粒，賦予宿主細(xì)胞致病性。

Col質(zhì)粒，降解質(zhì)粒，質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（5）質(zhì)粒的存在形式

有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移率。其中走在最前面的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口，OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口，L構(gòu)型）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（1）pUC是在pBR322基礎(chǔ)上發(fā)展起來的克隆載體。大小為2.7kb，帶有復(fù)制起始位點(diǎn)，ampicillin抗性基因和lacZ

基因。常用質(zhì)粒載體介紹第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（2）pGEM-3Z

帶有

LacZ

基因，大小為2.9kb，氨芐青霉素抗性基因，高拷貝。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（3）pBluescriptSK

pBluescriptSK同pGEM類似，另外還帶有線狀噬菌體f1的復(fù)制起始位點(diǎn)。

可以產(chǎn)生單鏈DNA。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)噬菌體載體一、噬菌體

1噬菌體的生物學(xué)特征

2噬菌體的侵染3噬菌體的DNA分子二、M13噬菌體第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體由正二十面體的蛋白質(zhì)頭部和中空管狀的蛋白質(zhì)尾部組成。頭部包含線狀染色體DNA，侵染寄主時(shí)將自己的DNA注入寄主細(xì)菌。噬菌體屬溫和噬菌體。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的生物學(xué)特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣殼).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的侵染噬菌體的侵染是溶源侵染，是噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，許多噬菌體DNA能整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體（prophage

）。而攜帶了原噬菌體的細(xì)菌被稱為溶源菌（lysogen）

。第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的侵染第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的侵染過程Lysogeniccycle

(溶源周期)：Undercertaincircumstances,however,thelambdaDNAinsertsitselfintotheE.colichromosomeandisastablepartofthechromosome.TheLambdaDNAisreplicatedalongWith

theE.colichromosome.Ifthehostcellbecomesdamaged,suchasUVtreatment,theprophageDNAexcisesitselfandundergoeslyticgrowth.第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的DNA分子DNA的分子為49kb,大多數(shù)基因已經(jīng)測(cè)序和定位。至少包括61個(gè)基因，其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分（b2區(qū)）可以被外源基因取代而不會(huì)影響到噬菌體的正常功能。第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的DNA分子

DNA在分子兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesiveendsite）.另外的作用是內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。

第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)噬菌體載體一、噬菌體二、M13噬菌體

1M13噬菌體的生物學(xué)特征

2M13噬菌體的侵染3M13噬菌體的載體第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一1.M13噬菌體的生物學(xué)特性

M13是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有6047bp的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，相對(duì)小，意味著可供插入的外源DNA的空間小。M13單鏈DNA的復(fù)制型（RF，replicativeform）是呈雙鏈環(huán)形，此時(shí)的DNA，不會(huì)插入細(xì)菌基因組，持續(xù)復(fù)制，當(dāng)積累到100-200個(gè)拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很快就阻止了負(fù)鏈的進(jìn)一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒。第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一M13噬菌體的侵染第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一作為載體的優(yōu)勢(shì)1基因組小于10kb,適合載體的要求。2復(fù)制時(shí)其雙鏈形式，可以像對(duì)質(zhì)粒一樣處理。3容易培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染，容易獲得基因組。4突出優(yōu)點(diǎn)在于可以提供單鏈DNA，這在DNA測(cè)序和體外突變中作用明顯。4在M13基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)，該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于載體的