生物分離工程技術第四張細胞破碎技術

4生物分離工程技術第四張細胞破碎技術目前一頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點第四講細胞破碎技術一、概述

二、常用的細胞破碎技術及其應用三、細胞破碎技術研究的發(fā)展方向

四、思考題目前二頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點一、概述（一）細胞破碎的意義（二）細胞壁的成分與結構（三）細胞破碎過程的檢測目前三頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（一）細胞破碎的意義目的：細胞破碎技術是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎。有效的細胞破碎對分離和純化任何細胞內(nèi)活性藥物成分都是必要的。細胞破碎與上游和下游工藝設計的關系上游通過細胞的生理狀態(tài)對細胞破碎效果產(chǎn)生影響；而下游則要考慮去除細胞碎片和細胞蛋白質的污染等對產(chǎn)品活性的影響。細胞破碎過程中必須考慮的因素

細胞壁的堅韌程度、目標產(chǎn)品的性質、破碎的規(guī)模、方法、費用等.目前四頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（二）細胞壁的成分與結構細菌細胞壁

主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀結構。霉菌的細胞壁

大多由幾丁質和葡聚糖構成，含有少量蛋白質和脂類。酵母和真菌的細胞壁

主要為葡聚糖為β-1，6葡聚糖，通過β-1，3糖苷鍵與D-葡萄糖第一側鏈交聯(lián)，也含有甘露糖和幾丁質植物細胞壁：含纖維素、半纖維素、木質素等目前五頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點原核細胞的結構

電鏡下：

（1）革蘭陽性菌細胞壁較厚，具有20～80nm的肽聚糖層，約占細胞壁干重的50％。（2）革蘭陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2—3nm，占細胞壁干重的10％左右。

（3）在肽聚糖層外還有一較厚的外壁層，約8～10nm，主要為脂蛋白、脂多糖和其他脂類，含量為細胞壁干重的80％。目前六頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點酵母細胞的結構目前七頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點植物細胞的結構目前八頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（三）細胞破碎過程的檢測①革蘭氏染色法②次甲基藍染色法③測定核酸與蛋白質含量④離心細胞破碎液觀察目前九頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點①革蘭氏染色法

用革蘭氏染色劑進行染色破壁的酵母呈粉紅色，而未破壁的酵母呈蘭紫色，分別計數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進行鏡檢記數(shù)，計算破壁率。α---破壁率（100%）C---破壁前的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）C’---破壁后的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）n1---染色后呈紫色細胞數(shù)n2---染色后呈粉紅色細胞數(shù)目前十頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點②次甲基藍染色法

取未經(jīng)滅活的發(fā)酵液0.5ｍＬ,用9ｇ/Ｌ的生理鹽水稀釋100倍后,用次甲基藍染色5ｍｉｎ,用血球計數(shù)板計數(shù),計算出細胞的存活率。酵母存活率：

=[1-(染色細胞總數(shù)/酵母細胞總數(shù))]×100%.目前十一頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點

③測定核酸與蛋白質含量

分別在260和280ｎｍ波長下,測定發(fā)酵液的光吸收值，用Lorry法測量細胞破碎后上清中的蛋白質含量也可以評估細胞的破碎程度，判斷細胞破碎率。核酸提高率：=[(處理后發(fā)酵液的吸光值/未處理發(fā)酵液的吸光值)-1]×100%目前十二頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點

④用離心細胞破碎液觀察

用離心細胞破碎液觀察沉淀模型的方法來確定細胞破碎率，完整的細胞要比細胞碎片先沉淀下來，并顯示不同的顏色和紋理。對比兩項，可以算出細胞破碎率。目前十三頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點二、常用的細胞破碎技術及其應用細胞破碎方式高壓勻漿

高速珠磨

納米磨破碎撞擊破碎

滲透壓沖擊超聲破碎凍融法低溫玻璃化酶溶法---溶菌酶、纖維素酶等機械法化學法---化學滲透

---超臨界細胞破碎技術物理法目前十四頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點(八)化學滲透法化學滲透法是使用某些有機溶劑(如苯、甲苯)、螯合劑(EDTA)、表面活性劑(SDS、tritonX-100)、變性劑(鹽酸胍、脲)等改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來?；瘜W滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結構與組成，不同試劑對各種微生物細胞作用的部位和方式有所差異?；瘜W滲透法有利也有弊目前十五頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點EDTAEDTA作為螯合劑，可用于處理革蘭氏陰性菌(如E．coli)，對細胞的外層膜有破壞作用。革蘭氏陰性菌的外層膜結構通常是靠二價陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質來維持的，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子將脫落，使外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，導致該區(qū)域通透性增強。目前十六頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點TritonX-100TritonX-100是非離子型清潔劑，對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是內(nèi)膜的雙磷脂層。tritonX—100常與其它試劑混合使用。目前十七頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點鹽酸胍和脲

鹽酸胍和脲是常用的變性劑。一般認為胍能與水中氫鍵作用，削弱了溶質分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能從大腸桿菌膜碎片中溶解蛋白。鹽酸胍不僅能改變細胞的通透性，而且能溶解不溶性重組蛋白(如包含體)，并在其它試劑的配合下使其二硫鍵斷裂，變性解離成單體，從而釋放出來。除去變性劑和雜蛋白后，在一定條件下恢復肽鏈內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，再折迭復性成具有活性的蛋白質立體結構。目前十八頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點化學滲透法的優(yōu)缺點優(yōu)點：①對產(chǎn)物釋出具有一定的選擇性。

例如用0.2mol／L胍處理E.coliC600-1，5h后80％位于胞間質的β-內(nèi)酰胺酶釋放出來，而總的蛋白釋放率僅為4％。②細胞外形完整；碎片少，有利于后分離。③核酸釋出少，漿液黏度低，便于進一步提取。缺點：①時間長，效率低。②化學試劑具有毒性。③通用性差。目前十九頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（一）高壓勻漿破碎法1、高壓勻漿閥及其破碎機理

2、溫控與能耗3、存在的問題

目前二十頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點1、高壓勻漿閥及其破碎機理

從高壓室(幾十兆帕)壓出的細胞懸浮液經(jīng)過閥座D的中心孔道，從D和閥C之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達每秒幾百米。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)E上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列過程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞的破碎。目前二十一頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點高壓勻漿破碎的動力學表達式S—細胞破碎率；k—破碎速率常數(shù)；p—壓力；N—循環(huán)次數(shù)；S，k，a，b，p等隨細胞種類和培養(yǎng)條件變化目前二十二頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點實驗室級高壓均質儀

目前二十三頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點高壓細胞破碎機目前二十四頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點2、溫控與能耗將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對于溫度敏感性物質，需低溫操作。機械破碎的能耗主要包括提供動力(如壓力)消耗的能量以及低溫操作耗費的能量。如，提高壓力需增加能耗(3.5kW／100MPa)，同時產(chǎn)生熱量(23.8℃／100MPa)。目前二十五頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點3、存在的問題高壓勻漿破碎技術適合細菌和部分酵母菌細胞的破碎處理，而不適用于絲狀微生物細胞的破碎，這是由于絲狀微生物會對破碎器產(chǎn)生堵塞作用。細胞破碎時濃度應在60％-80％(濕重／體積)，高于這個濃度時破碎效果有所降低。目前二十六頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（二）高速珠磨法

高速珠磨的破碎機理

溫控、能耗及存在的問題高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣目前二十七頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點1、高速珠磨的破碎機理如：株磨式組織研磨器小型株磨器

微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑(通常是直徑<1mm的無鉛玻璃珠)在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細胞之間的互相剪切、碰撞促進細胞壁破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走目前二十八頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點細胞破碎動力學表達式S—細胞破碎率；k—破碎速率常數(shù)；t—細胞破碎時間，t=V/R，V為細胞懸浮液體積m3，R為懸浮液流量m3/s。目前二十九頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點珠磨式組織研磨器

利用微細玻璃珠，在高速運轉下的相互碰撞，造成組織細胞的破裂與分散。適合珍貴樣品液的研磨，例如蛋白質、酶及細胞液等。微細玻璃珠可回收使用。樣品處理量，含玻璃珠可達350ml。

樣品量可達80克

目前三十頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點小型珠磨器特點：密閉容器可容納1至1.5ml的組織液或是一些細胞懸濁液，通過1至3分鐘的劇烈攪拌，能使細胞徹底的破裂，甚至一些骨頭、微生物的孢子通過玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。玻璃珠適用性：細菌用0.1mm的玻璃珠，酵母、藻類和組織培養(yǎng)細胞用0.5mm的玻璃珠，動植物的組織用1mm的玻璃珠目前三十一頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點2、溫控與能耗采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫度控制提高破碎率，需要增加裝珠量、提高轉速和延長破碎目前三十二頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點3、高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣

高壓勻漿法操作參數(shù)少，易于確定，而且樣品損失量少，最少可處理20ml懸浮液；珠磨機操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗估計，并且珠子之間的液體損失使一次處理85ml懸浮液最終只能得到50ml左右的漿液。連續(xù)操作時，珠磨機兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性，而高壓勻漿器需配備換熱器進行級間冷卻；其次珠磨法破碎效率高，目前三十三頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（三）超聲波細胞粉碎機1、基本原理2、影響因素

3、實驗室連續(xù)破碎池結構示意圖

目前三十四頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點超聲波細胞粉碎機基本原理

超聲波破碎機由超聲波發(fā)生器和換能器組成。超聲波發(fā)生器將50Hz220V市電變成20KHz電能供給換能器。換能器隨之作縱向機械振動。振動波通過浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應，激發(fā)介質里的生物微粒劇烈振動，引起的沖擊波和剪切力使細胞破碎。空化現(xiàn)象：是在強超聲波作用下，氣泡形成、長大和破碎的現(xiàn)象。目前三十五頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點影響超聲波破碎的因素

超聲波的聲強、頻率、溫度控制能力和破碎時間。細胞懸浮液的離子強度、pH和細胞種類等對破碎效果也產(chǎn)生影響。發(fā)射針的快速振動會產(chǎn)生大量的熱，在使用中必須每間隔幾分鐘關掉發(fā)生器以消散熱量。超聲波破碎時細胞濃度一般在20％左右，高濃度和高黏度都會降低破碎速度。超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質變性失活，噪聲令人難以忍受，而且大容量裝置的聲能傳遞、散熱均有困難。目前三十六頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點實驗室連續(xù)破碎池結構示意圖

目前三十七頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（四）膠體磨-納米破碎機膠體磨的原理膠體磨基本參數(shù)目前三十八頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點膠體磨原理膠體磨的基本工作原理是剪切,研磨及高速攪拌作用。磨碎依靠兩個齒形面的相對運動,其中一個高速旋轉另一個靜止,使通過齒面之間的物料受到極大的剪切力及磨擦力,同時又在高頻震動,調(diào)整旋渦等腰三角形復雜力的作用下使物料有效的分散、浮化、粉碎、均質。目前三十九頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點膠體磨基本參數(shù)

型號L50L65L80L80FL100乳化細度(um)≥2

≥2≥2≥2調(diào)節(jié)范圍(mm)1-0.01

1-0.011-0.011-1.01產(chǎn)量(T/h)0.01-0.05

0.01-0.050.5-10.5-3電機功率(KW)1.11.53.04.05.5電壓(V)380

380380380轉速(r/min)29002900

29002900磨片直徑(mm)506580100出口直徑(寸)?5/8

?5/8?3/2

?3/2進口直徑(寸)?5/4

?5/4

?2?5/2冷卻水管徑(寸)

?1/4

?1/4重量(kg)4050100200150目前四十頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（五）撞擊破碎法

細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(凍結速度為數(shù)千℃／min)，形成粒徑小于50μm的微粒子。高速載氣(如氮氣，流速約300m／s)將凍結的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結的細胞發(fā)生破碎。

目前四十一頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點撞擊破碎的特點細胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細胞破碎程度均勻，可避免細胞反復受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象。另外，細胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細胞內(nèi)部結構的破壞，適用于細胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細胞和植物細胞的破碎，通常處理細胞懸浮液濃度為10％～20％。實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50-500ml，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在10L／h以上。目前四十二頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（六）滲透壓沖擊破碎法

滲透壓沖擊破碎法是將細胞放在高滲透壓溶液中(如25％的蔗糖或甘油溶液)，由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分向外滲出，細胞收縮，此時快速將細胞轉移至低滲緩沖液中(如水溶液)，由于滲透壓的突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細胞快速膨脹而破裂的細胞破碎技術。細菌、真菌類和植物細胞的細胞壁強度較高，滲透壓沖擊破碎法很少用于此類細胞的破碎目前四十三頁\總數(shù)四十八頁\編于二十點（七）低溫玻璃化破碎技術低溫玻璃化破碎技術是在低溫玻璃化保存過程中發(fā)生的低溫斷裂基礎上提出來的