大腸菌群檢測操作規(guī)范培訓

（優(yōu)選）大腸菌群檢測操作規(guī)范培訓目前一頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點目錄一、細菌介紹二、大腸桿菌生物學特性三、大腸桿菌檢測儀器、設備四、檢測培養(yǎng)基及試劑五、檢測前培養(yǎng)基準備六、接種培養(yǎng)七、MPN單位介紹八、檢測注意事項目前二頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點一、細菌介紹細菌是單細胞原核微生物，個體微?。毎睆郊s0.5μm,0.5-5μm），結(jié)構(gòu)簡單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細菌分布最廣、數(shù)量最多。目前三頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點1、細菌的形態(tài)

細菌個體微小、形態(tài)各異球菌桿菌弧菌與彎曲菌螺旋菌及螺旋體不規(guī)則形弧菌目前四頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點2、細菌的結(jié)構(gòu)

細菌的基本結(jié)構(gòu)包括：細胞壁、細胞膜、間體、細胞漿、核糖體、細胞質(zhì)。細菌的附屬結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)粒、莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞。目前五頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點3、細菌的繁殖

細菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延長菌體，染色體復制為二，然后垂直于長軸分裂，細胞赤道附近的細胞質(zhì)膜凹陷生長，直至形成橫隔膜，同時形成橫隔壁，這樣便產(chǎn)生兩個子細胞。

目前六頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點4、細菌的菌落

單個或少數(shù)細菌細胞生長繁殖后，會形成以母細胞為中心的一堆肉眼可見、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團－菌落。目前七頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點細菌菌落常表現(xiàn)為濕潤、粘稠、光滑、較透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致等。

目前八頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點細菌的菌落圖目前九頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點二、大腸桿菌生物學特性大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括埃希氏菌、檸檬酸細菌、腸桿菌、克雷伯氏菌等，均屬于腸桿菌。目前十頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點大腸菌群以大腸埃希氏菌為主，是革蘭氏陰性、兩端鈍圓的桿菌，無芽孢，以周生鞭毛運動或不運動。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。目前十一頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點1、大腸桿菌平板菌落圖片目前十二頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點2、大腸桿菌革蘭氏染色圖片目前十三頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點3、大腸桿菌微菌落圖片目前十四頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點4、大腸桿菌透射電鏡圖片目前十五頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點5、大腸桿菌掃描電鏡圖片目前十六頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點6、大腸桿菌分裂圖片目前十七頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點三、檢測儀器、設備

冰箱：0～4℃

恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃

恒溫水浴鍋：46±1℃

微生物顯微鏡目前十八頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點架盤藥物天平：0g～500g，精確至0.5g

三角瓶：500ml

滅菌吸管：1ml、10ml

滅菌平皿：直徑90mm

試管：18×180mm目前十九頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點四、檢測培養(yǎng)基及試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍瓊脂乳糖發(fā)酵管革蘭氏染色液生理鹽水目前二十頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測定。35g乳糖膽鹽于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，115℃15分鐘高壓滅菌。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其它成分加倍。目前二十一頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點乳糖發(fā)酵管：大腸菌群證實試驗用。30g乳糖于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，115℃15分鐘高壓滅菌。目前二十二頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點伊紅美蘭瓊脂：用于大腸菌群的固體平板檢測。37.5g于1升蒸餾水中，搖勻，加熱煮沸，121℃15分鐘高壓滅菌。目前二十三頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點五、檢測前培養(yǎng)基準備

檢查預先經(jīng)過滅菌處理的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基小導管內(nèi)是否有氣體。按產(chǎn)品品種將培養(yǎng)基分別放在試管架內(nèi)，同時將9ml0.85%滅菌鹽水管也放入相應的試管架內(nèi)。目前二十四頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點六、接種培養(yǎng)

（一）酸牛奶系列產(chǎn)品酸牛奶系列產(chǎn)品接種單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基9支管，分別接種樣品量為1ml(原濃度)3支，0.1ml(10-1濃度)3支，0.01ml(10-2濃度)3支。

目前二十五頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點1、1ml接種培養(yǎng)在無菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取1ml樣品試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:10的稀釋液；同時分別吸取1ml樣品試液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前二十六頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點2、0.1ml接種培養(yǎng)另換1根1ml滅菌移液管吸取1:10的稀釋液1ml于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:100的稀釋液；同時分別吸取1ml1:10稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前二十七頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點3、

0.01ml接種培養(yǎng)另換1根1ml滅菌移液管分別吸取1ml1:100稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前二十八頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點4、接種過程操作錄像檢測\單料大腸檢測.MPG目前二十九頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點討論錄像中存在的問題：1、整個微生物檢測前應先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕輕抖出。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。5、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。目前三十頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點5、接種后培養(yǎng)將接種完的試管連同試管架一起置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。目前三十一頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點6、結(jié)果查詢并記錄若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報告大腸菌群陰性。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。目前三十二頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點（二）活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品接種雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基3支管，單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基6支，分別接種樣品量為10ml3支，1ml3支，0.1ml3支。目前三十三頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點1、10ml接種培養(yǎng)在無菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取1ml樣品試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:10的稀釋液；同時用10ml滅菌吸管分別吸取10ml樣品試液于3支雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前三十四頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點2、1ml接種培養(yǎng)另用1ml滅菌移液管分別吸取1ml樣品試液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前三十五頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點3、0.1ml接種培養(yǎng)另換1根1ml滅菌移液管分別吸取1ml1:10稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。目前三十六頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點4、接種過程操作錄像檢測\雙料大腸檢測.MPG目前三十七頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點討論錄像中存在的細節(jié)問題：1、整個微生物檢測前應先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時，注意用手托住吸管筒輕輕抖出。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺和酒精燈。5、剪刀用完后及時的進行擦拭干凈。目前三十八頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點5、接種后培養(yǎng)將接種完的試管連同試管架一起置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。目前三十九頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點6、結(jié)果查詢并記錄若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報告大腸菌群陰性。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實試驗。目前四十頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點（三）證實試驗1、伊紅美藍瓊脂平板分離將產(chǎn)酸產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的培養(yǎng)物分別接種于伊紅美蘭瓊脂平板(劃線分離)，置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。目前四十一頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀目前四十二頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點平板分離畫線法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法目前四十三頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點將伊紅美藍瓊脂平板從培養(yǎng)箱取出后,觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和乳糖復發(fā)酵試驗。革蘭氏染色：見《革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范》。目前四十四頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點（四）乳糖發(fā)酵試驗挑取可疑菌落進行革蘭氏染色后接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。目前四十五頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點凡是革蘭氏陰性無芽孢桿菌乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌落即可報告大腸菌群陽性。目前四十六頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點根據(jù)證實為大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，查找每100ml樣品內(nèi)的大腸菌群的MPN值。目前四十七頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點七、MPN單位介紹MPN=MostProbableNumber，最大可能數(shù)，是一種利用統(tǒng)計學檢測微生物的方法。食品大腸菌群是以每克或100ML中大腸菌群的最近似值，是用MPN來表示。目前四十八頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點采用9管法，對樣品選三個稀釋度，每個稀釋度接種三管相應的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后根據(jù)情況做出判斷陽性和陰性，再根據(jù)不同稀釋度的陽性管數(shù)查表即可得到被測樣品相應指標的MPN值。目前四十九頁\總數(shù)五十一頁\編于十八點八、注意事項

乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)小導管內(nèi)如無氣泡，需輕振試管，若有