小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及β肌動蛋白的表達

小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及B肌動蛋白的表達朱道立;陳佩林;王康樂;葛娟;別林【摘要】目的體外分離培養(yǎng)和純化小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)B肌動蛋白(P-actin)的表達情況.方法采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法及差速貼壁法純化ICR小鼠后肢骨骼肌腓腸肌(快肌)和比目魚肌(慢肌)衛(wèi)星細(xì)胞，免疫熒光抗體細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定.取第2代快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞提取總RNA,以GAPDH作為內(nèi)參行RT-PCR,半定量分析快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)P-actin基因的相對表達量.結(jié)果體外分離及傳代培養(yǎng)快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的快、慢肌肌漿蛋白表達陽性，細(xì)胞生長和增殖情況良好.快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)P-actin基因的相對表達量分別為3.71072和2.106028,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).結(jié)論小鼠快肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)P-actin表達高于慢肌，提示骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)P-actin表達可能與肌纖維類型有關(guān).％ObjectiveTocultureandpurifythemousesatellitecellsofgastrocnemiusandsoleusmusclesinvitro,anddetecttheexpressionofP-actinincells.MethodsSkeletalmusclesatellitecellsofgastrocnemiusandsoleusmusclesofICRmicewerepurifiedbycollagenaseandtrypsindigestionanddifferentialadhesionmethod,andwereidentifiedbyimmunofluorescentantibodycytochemicalstaining.TotalRNAwasextractedfromthesecondgenerationofgastrocnemiusandsoleusmuscles,andsemiquantitativeRT-PCRwasperformedtodetecttherelativeexpressionofP-actingenewithGAPDHasaninternalstandard.ResultsTheexpressionoffast-andslow-myosinwaspositiveinsatellitecellsofgastrocnemiusandsoleusculturedinvitro,withfavorablecellgrowthandproliferation.TherelativeexpressionofP-actingeneingastrocnemiusandsoleusmuscleswas3.71072and2.106028,respectively(P<0.01).ConclusionTheexpressionof[3-actiningastrocnemiusishigherthanthatinsoleusmuscle,whichsuggeststheexpressionof[3-actinmayberelatedtothetypesofmusclefibers.【期刊名稱】《上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)》【年(卷)，期】2011(031)001【總頁數(shù)】5頁(P26-30)【關(guān)鍵詞】P肌動蛋白;衛(wèi)星細(xì)胞;體外;骨骼肌;快肌;慢肌;小鼠【作者】朱道立;陳佩林;王康樂;葛娟;別林【作者單位】南通大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院，南通,226007;南通大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院，南通226007;南通大學(xué)住命科學(xué)學(xué)院，南通,226007浦通大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院，南通,226007;南通大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,南通,226007【正文語種】中文【中圖分類】Q786;Q2;R-332骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種位于肌纖維肌膜與基膜之間的多潛能干細(xì)胞，在負(fù)重和創(chuàng)傷等應(yīng)激條件下可被激活進入有絲分裂期和增殖期，進一步分化融合形成肌管而參與骨骼肌的修復(fù)。國夕卜文獻［1］報道骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞移植能夠改善急性心肌梗死動物模型的局部血液循環(huán)，但作用機制尚不清楚。趙志強等［2］的研究表明：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞移植能延緩骨骼肌萎縮的進展。此外，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞移植還可用于治療肌營養(yǎng)不良性萎縮、壓力性尿失禁和輸尿管反流等疾?。?］。微絲是存在于所有真核細(xì)胞中的實心狀纖維，含量占細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的1%~2%,但在活動較強的細(xì)胞中可占20%-30%;微絲主要由肌動蛋白(actin)構(gòu)成，其與肌球蛋白(myosin)協(xié)同作用使細(xì)胞運動，兩者間的相對滑動使肌肉產(chǎn)生收縮。鑒于肌動蛋白各亞型表達與物種無關(guān)的組織學(xué)特異性［4］，本實驗采用RT-PCR方法研究P肌動蛋白甲-actin)基因在小鼠后肢腓腸肌(快肌)與比目魚肌(慢肌)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達情況，分析P-actin基因表達與肌纖維類型間的關(guān)系。1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物清潔級成年ICR小鼠6只，雌雄不拘，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號碼為SCXK(蘇)2008-0010；使用許可證號碼為SYXK(蘇)2007-0021。1.1.2主要試劑I型膠原酶、胰蛋白酶、L多聚賴氨酸(Sigma);DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和青、鏈霉素(Gibco);骨骼肌快肌肌漿蛋白(fast-myosin)(BM0096)、骨骼肌慢肌肌漿蛋白(slow-myosin)(BM1533)抗體和SABC-Cy3抗體試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；氯仿、異丙醇、DEPC、TBE、TRIzol試劑、RNase-freeH2O、Oligo(dT)18Primer、5xReactionBuffer、RNnase抑制劑、dNTP混合液、M-MLVRT、10xBuffer、MgCl2、Taq酶、DL2000和10xLoadingBuffer(上海捷瑞生物技術(shù)公司)。1.2骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離純化、傳代培養(yǎng)及鑒定將成年ICR小鼠拉頸椎處死，75%乙醇消毒后分別取出后肢腓腸肌與比目魚肌置于平皿內(nèi)。用D-Hank液洗滌3次，并剔除脂肪、結(jié)締組織及筋膜等。用手術(shù)剪將肌肉剪成肉糜狀(1mm3)轉(zhuǎn)移至離心管中，再用D-Hank液洗3次。向上述離心'管先后加入0.25%I型膠原酶和0.25%胰蛋白酶，37°C下水浴消化各20min,每隔5min用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。加入生長培養(yǎng)基終止消化，依次濾過100、200、400目篩網(wǎng)，收集濾液，1000r/min離心10min，棄上清后用生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，37°C培養(yǎng)4h，多次換瓶差速貼壁培養(yǎng)以去除貼壁的成纖維細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞。3d后換液，以后2~3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞達到80%-90%融合后，棄去培養(yǎng)液，加入適量0.25%胰酶溶液消化，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化；用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層，直至細(xì)胞脫落分散。以1:2的比例進行傳代，2~3d換液1次；培養(yǎng)5d后進行第2次傳代，繼續(xù)培養(yǎng)3~4d。取第2代的培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)濃度為580nm的紫夕卜光激發(fā)后，在倒置相差熒光顯微鏡下觀察并拍照。同時，以0.25%胰蛋白酶液分別消化快肌(腓腸肌)和慢肌(比目魚肌)衛(wèi)星細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)；采用fast-myosin、slow-myosin免疫熒光抗體細(xì)胞化學(xué)染色法(SABC-Cy3法)鑒定快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞。具體操作步驟：4%多聚甲醛固定30min;PBS洗2minx3次；正常血清封閉液室溫10min;加入一抗4C過夜；PBS洗2minx3次；加入二抗37C30min；PBS洗2minx3次；SABC-Cy3熒光染色;PBS洗5minx4次；熒光顯微鏡鏡檢鑒定。RT-PCR檢測骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞p-actin基因表達1.3.1總RNA提取及其完整性檢測將快、慢肌的第2代肌衛(wèi)星細(xì)胞移至經(jīng)0.1%DEPC水浸泡處理的EP管(1.5mL)中，加入1mL的TRIzol試劑，充分混勻后室溫靜置3min；4C下1000r/min離心10min，將上清液移至另一經(jīng)0.1%DEPC水浸泡處理的EP管(1.5mL)中，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置10min；4C下1200r/min離心10min，取上層最透明上清液并將其轉(zhuǎn)移至經(jīng)0.1%DEPC水浸泡處理的EP管(1.5mL)中，加入等體積異丙醇0.5mL混勻，室溫靜置20~30min；4C下1200r/min離心10min，棄上清，向沉淀中加入75%乙醇1mL,用槍打起沉淀對RNA進行清洗；4C下1200r/min離心3min，棄上清,在空氣中晾干。加入30pLRNase-freeH2O，使RNA充分溶解。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠檢測提取RNA的完整性。1.3.2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈以提取的總RNA為模板，用M-MLV酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA。從溶有RNA的30pLRNase-freeH2O內(nèi)吸取12pL,再加入1pLOligo(dT)18Primer。輕輕混勻后，70°C水浴5min后冰浴30s。再加入4pL5xReactionBuffer、1pLRNnase抑制劑、1pLdNTP混合液，輕輕混勻后離心3~5，；加入1pL的M-MLVRT,終體積為20pL;反應(yīng)混合物經(jīng)37C水浴40~60min,70C水浴10min后立即進行PCR擴增或-20C保存。PCR擴增和電泳檢測以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，以GAPDH基因作為內(nèi)參檢測小鼠后肢快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞p-actin表達。PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系(25pL):單鏈cDNA2pL、ddH2O17.8pL、10xPCRBuffer2.5pL、MgCl21.2pL、GAPDH或pactin上游和下游引物各0.5pL、dNTP0.25pL、Taq酶0.25pL。GAPDH擴增：94C預(yù)變性5min;941變性30s、591退火30s(GAPDH)或551退火30s(p-actin)、72C延伸30s,24個(GAPDH)或25個(p-actin)循環(huán)；72C再延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)添加了EB的瓊脂糖凝膠檢測，包括配膠、點樣、電泳和電泳圖譜分析。1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用ScionImage軟件進行電泳圖譜分析。以目的基因(p-actin)條帶灰度與內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度的比值表示目的基因的相對表達量，比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表1PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab1PrimersequencesandproductlengthforPCR基因引物序列(5—3)產(chǎn)物長度/bpp-actin上游：TCATCACTATTGGCAACGACG399下游:AACAGTCCGCCTAGAAGCAC內(nèi)參GAPDH上游:AGGCCGGTGCTGAGTATGTC530下游：TGCCTGCTTCACCACCTTCT2結(jié)果2.1體外分離培養(yǎng)的快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定2.1.1原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：分離純化的快、慢肌原代衛(wèi)星細(xì)胞為圓形、折光性強，48h后開始貼壁，96h后完全貼壁，細(xì)胞呈梭形或紡錘形，中間夾雜少量未過濾掉的纖維碎片；細(xì)胞生長緩慢。隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞逐漸有規(guī)律地平行排列（圖1A、B）；待細(xì)胞密度達到90%左右時，進行快、慢骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，室溫下50s消化結(jié)果最佳，1:2接種于培養(yǎng)瓶中，1d后開始貼壁，2d后貼壁完全（圖1C、D），增殖速度也比原代細(xì)胞快。2.1.2第2代快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒定快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞傳至第2代時，3~4d內(nèi)細(xì)胞相互融合排列出現(xiàn)方向性（圖1E、F）。fast-myosin鑒定快肌衛(wèi)星細(xì)胞呈現(xiàn)紅色窄長條形，slow-myosin鑒定慢肌衛(wèi)星細(xì)胞呈現(xiàn)紅色寬短外形（圖1G、H）。2.2小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞p-actin表達2.2.1總RNA的完整性小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA電泳圖見圖2。提取的總RNA有清晰且完整的兩條條帶，分別為28S和18S，兩者在寬度與亮度上相比，28S>18S,且接近2倍的關(guān)系。A.原代培養(yǎng)4d的快肌衛(wèi)星細(xì)胞；B.原代培養(yǎng)6d的慢肌衛(wèi)星細(xì)胞；C.傳1代后培養(yǎng)3d的快肌衛(wèi)星細(xì)胞；D.傳1代后培養(yǎng)4d的慢肌衛(wèi)星細(xì)胞；E.傳2代后培養(yǎng)2d的快肌衛(wèi)星細(xì)胞；F.傳2代后培養(yǎng)2d的慢肌衛(wèi)星細(xì)胞；G.快肌衛(wèi)星細(xì)胞fast-myosin免疫熒光抗體染色呈窄長條形；H.慢肌衛(wèi)星細(xì)胞slow-myosin免疫熒光抗體染色呈寬短外形。圖1體外分離培養(yǎng)的小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定Fig1Identificationofmousefastandslowsatellitecellsculturedinvitro1.腓腸肌快肌衛(wèi)星細(xì)胞；2.比目魚肌慢肌衛(wèi)星細(xì)胞。圖2小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA電泳圖Fig2ElectrophoreticmapoftotalRNAofmousefastandslowsatellitecellsPCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在250bp與500bp之間可見擴增片段，在500bp上方靠近500bp處也可見擴增片段；小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞分別經(jīng)PCR擴增的GAPDH兩條帶亮度和寬度相似；小鼠快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)PCR擴增出的p-actin兩條帶亮度和寬度明顯不同(圖3)。ScionImage軟件分析結(jié)果快、慢肌衛(wèi)星細(xì)胞p-actin相對表達量分別為3.71072和2.10603，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。0.MarkerDL2000;1、2.快肌衛(wèi)星細(xì)胞GAPDH和p-actin表達；3、4.慢肌衛(wèi)星細(xì)胞GAPDH和p-actin表達。圖3GAPDH和p-actin的RT-PCR擴增電泳圖Fig3ElectrophoreticmapofRT-PCRinGAPDHandp-actin3討論由于各種消化酶的作用機制和消化條件不同，本研究經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞通過I型膠原酶和胰蛋白酶分解，將消化條件嚴(yán)格控制在37°C、20min實驗效果較好。采用胎牛血清作為原代和傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，將其濃度控制在10%-20%,因為濃度過高可促使細(xì)胞增殖，低于5%則促使其分化。由于小鼠肌肉組織較脆弱，消化時間過長可能導(dǎo)致衛(wèi)星細(xì)胞損傷。本實驗采用I型膠原酶結(jié)合胰蛋白酶消化法松解肌肉組織，使肌衛(wèi)星細(xì)胞達到最大產(chǎn)出率而又不損傷其貼壁能力；兩種酶的消化時間均控制在20min左右；通過離心、差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞［5］。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的正常分化過程:首先分化為成肌細(xì)胞，細(xì)胞呈平行排列，相互融合在一起，然后在中央、肌絲和周邊的肌管形成細(xì)胞核。細(xì)胞骨架中間絲的構(gòu)成為中空的骨狀結(jié)構(gòu)，直徑介于微管和微絲之間，其化學(xué)組成比較復(fù)雜；在不同細(xì)胞中，成分變化較大。中間絲使細(xì)胞具有張力和抗剪切力。隨著分化過程的深入，肌絲不斷生長并形成肌原纖維，細(xì)胞核則逐漸移向周邊形成肌纖維。本實驗采用10%胎牛血清作為生長培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長分化。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞呈平行排列，具有明顯的方向性；這與其在體內(nèi)的排列方式，即與肌纖維長軸平行的情況相符合；因肌細(xì)胞要完成功能性收縮，要求細(xì)胞的排列必須具有同向性。Actin基因編碼序列具有高度保守性，而非編碼序列有較大的差異，反映其進化的時間進程。Actin作為收縮蛋白是細(xì)肌絲的主要成分，占肌原纖維蛋白的20%~25%[5]。肌肉內(nèi)actin的形式主要是纖維形式即F-actin，是G-actin的多聚體形式；正是由于G-actin/ATP/Mg2+復(fù)合物聚集才能形成F-actin多聚物。Actin與粗肌絲內(nèi)的肌球蛋白循環(huán)接觸與分離，使肌纖維縮短并產(chǎn)生張力°a、B、Y-actin中，a-actin存在于肌細(xì)胞中，而B、Y-actin大部分存在于非肌細(xì)胞中。動物的P-actin基因通常位于染色體2q；但本研究中的小鼠骨骼肌異型actin編碼基因位于染色體3q[6]。骨骼肌內(nèi)的P-actin能夠結(jié)合肌肉中actin的纖維形式F-actin,在限制細(xì)微絲的長度上發(fā)揮重要作用，從而參與多種真核細(xì)胞的機能，包括細(xì)胞收縮、變形、激化和細(xì)胞分裂等。中間絲有共同的基本結(jié)構(gòu)，即構(gòu)建成一個中央a螺旋桿狀區(qū)，兩側(cè)則是大小和化學(xué)組成不同的端區(qū)。端區(qū)的多樣性決定了中間絲外形和性質(zhì)的差異性和特異性。以上這些結(jié)構(gòu)單元并非一成不變，而是隨著細(xì)胞的生命活動而呈現(xiàn)高度的動態(tài)性，它們均由單體蛋白以較弱的非共價鍵結(jié)合在一起，構(gòu)成纖維型多聚體，很容易進行組裝和去組裝，這正是實現(xiàn)其功能所需要的特質(zhì)。不僅如此，細(xì)胞骨架還包含有很多結(jié)構(gòu)單元的附屬蛋白質(zhì)，如分子馬達的動力蛋白和結(jié)合蛋白等。廣義的細(xì)胞骨架還包括核骨架、核纖層和細(xì)胞外基質(zhì)，形成貫穿于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外的一體化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?？旒⌒l(wèi)星細(xì)胞通過加帽蛋白促使肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物產(chǎn)生更多纖維成核，經(jīng)過重構(gòu)組成枝狀肌動蛋白網(wǎng)支持快速運動作用；而在慢肌衛(wèi)星細(xì)胞，通過加帽蛋白促使肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物產(chǎn)生較少纖維成核，經(jīng)過重構(gòu)組成枝狀肌動蛋白網(wǎng)發(fā)揮慢速運動機能。運動過程中，首先由快、慢肌內(nèi)的I型慢縮氧化肌纖維發(fā)動，進行有氧代謝；HD型快縮氧化肌纖維和HA型快縮氧化酵解肌纖維逐漸參與活動，使運動力量逐漸增加；最后由HB型快縮無氧酵解肌纖維加速運動，提高速度和力量。比目魚肌位于小鼠后肢深面，以I型慢縮氧化肌纖維為主，有少量HD型快縮氧化肌纖維和HA型快縮氧化酵解肌纖維，但無HB型快縮無氧酵解肌纖維，以穩(wěn)定踝關(guān)節(jié)和保持軀體平衡的功能。而分布淺層的腓腸肌除含有I型慢縮氧化肌纖維、HD型快縮氧化肌纖維和HA型快縮氧化酵解肌纖維外，主要以大部分HB型快縮無氧酵解肌纖維為主；腓腸肌通常在比目魚肌作用的基礎(chǔ)上發(fā)揮快速奔跑和跳躍機能［7］。有研究［8］表明：在不同物種中出-actin蛋白基因表達會受各種生理狀態(tài)或環(huán)境調(diào)控而出現(xiàn)表達差異。本研究采用半定量RT-PCR方法研究p-actin基因在小鼠快肌(腓腸肌)和慢肌(比目魚肌)衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)的表達情況，結(jié)果顯示P-actin基因在快肌衛(wèi)星細(xì)胞的相對表達量較高，而在慢肌衛(wèi)星細(xì)胞的相對表達量則較低；提示骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)P-actin基因表達與肌纖維類型有一定關(guān)系，表達差異可能與不同肌肉組織的運動機制和生長發(fā)育有關(guān)。［參考文獻］［1］ 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