綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)-配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)部分

綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)——配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)部分切割DNA的金屬配合物指導(dǎo)教師：毛宗萬(wàn)

黃華珍huanghuazhen@中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院2009年10月/ChemEdu/Echemi/comlab/index.htm第一頁(yè)，共二十九頁(yè)。實(shí)驗(yàn)3功能型甘氨酸銅配合物的合成和表征模板合成IR光譜表征自由基的UV光譜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)4功能型甘氨酸銅配合物對(duì)質(zhì)粒DNA的切割瓊脂糖凝膠電泳凝膠成像總學(xué)時(shí)：15學(xué)時(shí)地點(diǎn)：豐盛堂218室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第二頁(yè)，共二十九頁(yè)。Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ線型DNA自由基機(jī)理自由基進(jìn)攻糖環(huán)或堿基，導(dǎo)致氧化破壞酯水解機(jī)理親核試劑進(jìn)攻磷原子，發(fā)生親核取代反應(yīng)酯水解機(jī)理優(yōu)于自由基機(jī)理DNA結(jié)構(gòu)及其斷裂方式第三頁(yè)，共二十九頁(yè)。配合物與未受損的DNA表面結(jié)合并誘導(dǎo)其斷裂進(jìn)一步在新的斷裂處結(jié)合斷裂反應(yīng)互補(bǔ)鏈的斷裂DNA的自由基斷裂第四頁(yè)，共二十九頁(yè)。實(shí)驗(yàn)背景——模擬博萊霉素在天然物質(zhì)中，由5個(gè)氨基酸、2個(gè)六碳糖和1個(gè)氨基側(cè)鏈構(gòu)成的博來(lái)霉素（bleomycin）可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂,從而作為一族廣譜抗菌抗腫瘤藥物。第五頁(yè)，共二十九頁(yè)。導(dǎo)致DNA鏈的斷裂原因是由于博來(lái)霉素分子的一部分是鐵或銅的配合物，這類配合物能夠產(chǎn)生導(dǎo)致DNA鏈斷裂的自由基。CuP-3A的配位結(jié)構(gòu)示意圖博萊霉素的活性中心第六頁(yè)，共二十九頁(yè)。Pamatong,F.V.;Detmer.C.A.,III;Bocarsly,J.R.;J.Am.Chem.Soc.,1996,118,5339.Detmer.C.A.,III;Pamatong,F.V.;Bocarsly,J.R.;Inorg.Chem.,1996,21,6292.博萊霉素的模型化合物Cu2++e-=Cu+

Cu++H2O2=Cu2++OH-+OH第七頁(yè)，共二十九頁(yè)。氨基酸銅化合物的合成路線第八頁(yè)，共二十九頁(yè)。模板反應(yīng)的化學(xué)機(jī)理第九頁(yè)，共二十九頁(yè)?；衔?的紅外光譜(COO-)(COO-)(NO2)(NO2)第十頁(yè)，共二十九頁(yè)。化合物2的紅外光譜(COO-)(COO-)(NH2)第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)。氫氧自由基的形成和UV光譜檢測(cè)由于羅丹明B可與HO·迅速反應(yīng)，并在553nm有強(qiáng)吸收，因此我們可以利用此反應(yīng)采用分光光度法檢驗(yàn)HO·的生成。

第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟龋循傊欠譃橐话悱傊呛偷腿埸c(diǎn)瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為62～65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)。第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)。凝膠濃度選擇——瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)。電泳緩沖液常用三種緩沖液

Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE)TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)。核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭、二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色，電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率2Kb1.6Kb第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)。核酸電泳的染色劑——溴化乙錠一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察ethidiumbromide，EB第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)。電泳實(shí)驗(yàn)裝置電泳儀（普通）電泳槽（水平平板）灌膠模具等第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)。電泳實(shí)驗(yàn)方法洗凈電泳槽，架好梳子配制瓊脂糖凝膠及倒膠上樣與通電結(jié)果觀察第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)。配制瓊脂糖凝膠及倒膠0.5×TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60℃(需要時(shí)可加入EB)，倒入電泳槽中，待凝固。向電泳槽中倒入0.5×TBE，其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)。上樣與通電在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為1—5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳。一般電泳條件為：電壓90V，時(shí)間40min。第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)。結(jié)果觀察和記錄紫外儀上觀察電泳帶及其位置拍照進(jìn)一步使用軟件對(duì)光密度進(jìn)行分析第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)。DNA斷裂的凝膠電泳圖Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ線型DNA第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)。合成實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)檢查回流裝置是否保持干燥硝酸銅在稱量前用濾紙吸干固體表面潮解的溶液合成實(shí)驗(yàn)中前半個(gè)小時(shí)注意觀察反應(yīng)混合物的顏色變化，亮藍(lán)色或紫藍(lán)色為反應(yīng)正常實(shí)驗(yàn)中化合物合成與DNA斷裂實(shí)驗(yàn)需交叉進(jìn)行，DNA斷裂所需的配合物由準(zhǔn)備室提供若硝基還原使用了較多溶劑，需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去多余溶劑凝膠電泳照相需戴手套第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)。模板合成——大環(huán)化合物的合成方法（218室）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器——除去多余溶劑（218室）紅外光譜——化合物結(jié)構(gòu)表征（201室）紫外可見(jiàn)光譜——跟蹤羅丹明B與氫氧自由基的反應(yīng)（204室）凝膠電泳——切割DNA（210室）凝膠成像分析——檢測(cè)DNA斷裂狀況（210室）實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)。實(shí)驗(yàn)要求寫好預(yù)習(xí)報(bào)告（查閱藥品及溶劑的性質(zhì)、羧基和硝基的IR特征峰值、光譜技術(shù)原理及思考題預(yù)習(xí)等）實(shí)驗(yàn)中做好實(shí)驗(yàn)記錄及相關(guān)計(jì)算（包括實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、產(chǎn)品重量、產(chǎn)率等）做好每一次測(cè)試，并打印結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)提交最終產(chǎn)品和測(cè)試圖譜供檢查對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作簡(jiǎn)要討論下一次實(shí)驗(yàn)提交本次實(shí)驗(yàn)報(bào)告遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則，嚴(yán)禁違規(guī)操作，做好清潔值日第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)。（配位化學(xué)、生物無(wú)機(jī)化學(xué)、生物技術(shù)）V.V.Gerbeleu,V.B.Arion,J.Burgess,“Templatesynthesisofmacrocycliccompounds”,WILEY-VCHverlagGmbH,1999.計(jì)亮年，黃錦汪、莫庭煥等編著，《生物無(wú)機(jī)化學(xué)》（第二版），中山大學(xué)出版社，2001。楊頻，高飛編著，《生物無(wú)機(jī)化學(xué)》，科學(xué)出版社，2002。F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓等，《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，1998年6月第1版。參考書第二十八頁(yè)，共二十九頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)——配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)部分。中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院。酯水解機(jī)理優(yōu)于自由基機(jī)理。實(shí)驗(yàn)背景——模擬博萊霉素。由于羅丹明B可與HO·迅速反應(yīng)，并在553nm有強(qiáng)吸收，因此我們可以利用此反應(yīng)采用分光光度法檢驗(yàn)HO·的生成。根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和?/p>