液相常見故障及技術(shù)問答

目錄1色譜柱使用壽命27最抱負(fù)的流速2保存時間變化28鍵和的碳鏈3保存時間漂移29pH緩沖4不同色譜柱和不同批次之間的重現(xiàn)性30流動相組分5樣品配制問題31柱子污染6峰形拖尾因素32方法驗證7正相色譜33糖類分析中的雙峰8系統(tǒng)體積，死體積，滯后體積34方法控制9梯度方法轉(zhuǎn)移35流動相pH10系統(tǒng)堵塞36改善信噪比11色譜柱塔板數(shù)37過載12柱壓38柱子的耐用性13峰面積變化 39快速分析和柱壓14鬼峰40反沖柱子15pH對保存時間的影響41選擇性的改變16柱平衡42新方法17柱改性43倒峰18復(fù)雜的樣品44麻煩，冗長乏味，費時19疏水坍塌45快速分析20基線噪音46LC/MS的緩沖液21小孔柱47反相色譜中的堿性緩沖液22樣品溶液48柱后衍生23梯度比例49梯度滯留體積24柱子保存50緩沖能力25離子對色譜51流速的變化與定量關(guān)系26反相填料的水解穩(wěn)定性52極性物質(zhì)的分析1色譜柱使用壽命問：我的色譜柱進(jìn)樣大約100針后峰形變差了，踏板數(shù)很低，怎么回事？答：100針的確很少，一般情況下使用時間會長很多的。一方面我們要確認(rèn)你的使用條件是不是導(dǎo)致色譜柱壽命下降的因素。兩種基本情況：1在相同實驗中以前使用的色譜柱壽命長很多2在本實驗中用過的所有的色譜柱在使用相同次數(shù)后所有損壞假如是第一種情況，應(yīng)當(dāng)檢查一下實驗是否保持一致。樣品的組成改變了嗎？樣品中強(qiáng)吸取的污染物會破壞色譜柱的柱效?；蛘吖苈返拿芊馊κ欠裢旰?？脫落的密封圈會堵塞色譜柱過濾器和填料的頂層，從而影響樣品的分布。假如可以確認(rèn)色譜條件沒有變化，那么可以推測是柱床松動的因素。在實驗室和運送過程中色譜柱劇烈的震動都會導(dǎo)致柱床松動。（色譜柱有沒有掉到地上？）或者也有也許使生產(chǎn)商的問題。并且這種問題標(biāo)準(zhǔn)色譜柱檢測中心是檢測不出來的，只有在用過一段時間后才會顯露出來。這種情況生產(chǎn)商會免費替換色譜柱。問：那些生產(chǎn)商真好，但是我的情況不是這樣的。我的色譜柱總是用不了多長時間。有時候100針，有時候200針。200針還可以忍受，但是100針太差了。色譜柱開銷太大了，我該怎么辦？答：我完全批準(zhǔn)你所說的。我們必須要找到因素然后看看我們能做些什么。最大也許是樣品中的成分吸附在色譜柱的頂端。也許是在流動相中不溶的沉淀物或者是強(qiáng)吸取的物質(zhì)。隨著進(jìn)樣的增長這些污染物在色譜柱頂端累積，阻止樣品正常吸附和擴(kuò)散。從而導(dǎo)致峰形變差。通常這種問題和柱壓升高同時出現(xiàn)。問：嗯，也許就是這個因素。我應(yīng)當(dāng)怎么避免這種問題呢？答：有幾種方法可以采用。一，采用合適的樣品準(zhǔn)備技術(shù)解決樣品。用和分析柱相似的固相萃取柱進(jìn)行固相萃?。⊿PE：solidphaseextraction）1效果很好。此外一種非常有效的方法是使用保護(hù)柱。保護(hù)柱是作為犧牲柱裝在色譜柱前使用的，出現(xiàn)問題的時候就會被替換掉。為了獲得最佳的分析效果，保護(hù)柱的填料和裝填技術(shù)必須和分析柱同樣。假如用不同品牌的填料就不能獲得最佳的分析性能和保護(hù)作用。不要用大些的顆粒型號，大的顆粒或裝填不好的預(yù)柱會因譜帶擴(kuò)展而導(dǎo)致分離效果變差。問：使用預(yù)柱聽起來不錯，尚有其他方法嗎？答：尚有其他一些方法，但是他們都有缺陷。我不提倡用那些也許溶解色譜柱頂端污染物的溶劑去沖洗柱子。很多情況下，這個方法是沒有作用的。例如，假如沉積在色譜柱頂端的污染物是蛋白質(zhì)，你沖洗的時候他們已經(jīng)變性很久了，甚至也許交聯(lián)在一起，變得難以溶解。此外，通常色譜柱是處在水解平衡狀態(tài)，而每次沖洗都會除掉水解鍵合相。因此，反復(fù)的沖洗柱子會加速柱子的老化。并且，沖洗后還要用流動相平衡柱子，假如是做離子對色譜的話會消耗大量的時間。另一個經(jīng)常用的方法是反沖柱子。假如用和流動相不同的溶劑沖洗會產(chǎn)生和上面相同的問題。假如用流動相的話，需要很長的時間才干除去污染物，也有也許主線就沒作用。同時，反沖柱子會削弱柱子。盡管現(xiàn)在的裝填技術(shù)可以使柱子承受反沖，但是一般情況下不要采用這種做法。問：那么最佳的建議就是使用預(yù)柱了？答：絕對是。預(yù)柱也沒那么貴-一般隨品牌和型號的不同價格在10$-50$之間，而他們所保護(hù)的柱子的價格是預(yù)柱的10倍左右啊。并且他們還可以避免其他來源的污染物的，這些污染物更加難以發(fā)現(xiàn)。這些來源涉及比如流動相中的灰塵，泵脫落的密封圈的碎片，或者從流動相吸附的污染物等等。其中有些難以對付，而保護(hù)柱就可以阻擋這些。問：尚有其他縮短柱子使用壽命的因素嗎？答：有的，但是只要你按照生產(chǎn)商的說明使用柱子的話一般很少發(fā)生。有一個也許就是流動相pH超過使用范圍而導(dǎo)致的柱子坍塌。樣品用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶解的話也會發(fā)生此外，一些特別的柱子有特別注意的地方例如氨基柱可以和醛，酮反映。氨基柱在不含緩沖鹽的水溶液中會顯強(qiáng)堿性，分解部分硅膠。暴露在錯誤溶劑中的柱子也會發(fā)生坍塌。由于這些柱子是基于非常松散的結(jié)構(gòu)。他們是因顆粒之間的黏著而部分的結(jié)合在一起的。假如置于能破化這種黏著的流動相中，柱床很有也許會坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有時就會發(fā)生這種問題。這也是不要沖洗柱子的另一個理由。2保存時間變化問：我的樣品峰的保存時間不一致，什么因素？答：一方面我們要知道是什么樣的變化，這有助于我們找到問題潛在的因素。假如在連續(xù)進(jìn)樣過程中出峰時間不規(guī)則的變化，那么一方面查看一下泵和溶劑混合裝置?？梢杂昧客埠兔氡韥頊y定流速，從而確認(rèn)泵是否在工作。在其中一種溶劑中加入示蹤劑，通過觀測基線擬定流動相的比例是否發(fā)生變化。假如流動相的比例不變，基線就是平穩(wěn)的。假如流動相的比例有變化，基線會發(fā)生相應(yīng)的變化。比如你當(dāng)你是使用紫外檢測器的反相色譜法時，可以在有機(jī)溶劑中添加0.1%的丙酮，在254nm監(jiān)測基線。此外，你也可以手動配制流動相而不用通過溶液混合裝置。這樣假如保存時間沒有變化，那么問題就是在混合裝置這里。問：連續(xù)進(jìn)樣過程中保存時間還是相稱一致的，但是隔天進(jìn)樣的話就不同樣了。答：這種情況的話不大也許使儀器的問題。最大也許是流動相組成的問題。在反相色譜中，保存因子k和流動相中有機(jī)相的比例是成指數(shù)關(guān)系的。通常，有機(jī)相變化1%，保存時間會變化5%-15%，一般是10%。這就是說你要非常準(zhǔn)確的配制溶液。最佳是按重量而不是按體積來配制。此外，脫氣的方法也會導(dǎo)致保存時間變化。最佳是真空超聲1min。這種方法溶劑蒸發(fā)的最少，效果很好。此外還可以采用氦氣脫氣法。在流動相和氦氣達(dá)成最初的平衡后，應(yīng)當(dāng)減少氦氣的流速。否則氦氣會帶走溶液的蒸氣，從而改變?nèi)芤旱谋壤?。假如你的樣品時離子型或者可以電離的化合物，控制流動相的pH就變得很重要了。pH變化0.1會導(dǎo)致保存時間變化10%。所以要準(zhǔn)確的測量pH，并且要校正好pH計。在反相色譜中隨著pH的增長，酸性化合物保存時間縮短，而堿性化合物延長。順便提一下，我的老師經(jīng)常說：一個緩沖液之所以被稱為緩沖液是應(yīng)為他對pH有緩沖作用。假如沒有緩沖作用，就不是一個緩沖液了。比如醋酸銨溶液就只是醋酸銨溶液，它不是緩沖液。一個醋酸鹽緩沖液有醋酸離子和醋酸。假如兩者在溶液中檔量存在，溶液的pH就是就是該緩沖液的pK值，醋酸鹽的pK值是4.75。緩沖液在pK值處有最大緩沖能力。問：我以前都不知道到控制流動相的組分和結(jié)果的重現(xiàn)性有這么密切的關(guān)系。尚有其它需要注意的變化嗎？答：此外一個重要的因素是溫度。假如所有的峰的保存時間都朝同一個方向變動，可以推測是溫度的影響。通常溫度每變化1℃保存時間變化1%-2%。一般情況下影響沒有那么大。在反相色譜中檢測離子型或離子化的化合物時，保存時間會因緩沖液的離子化能力不同而變化。但是這種影響微乎其微，通常都可以忽略的。標(biāo)準(zhǔn)情況下緩沖液的摩爾數(shù)改變20%保存時間會改變1%。由于配制緩沖液經(jīng)常是稱量的，所以不大也許犯這么大的錯誤。問：有沒有其他一些特別的情況需要考慮一些額外的參數(shù)？答：有的。在離子對色譜中，離子對試劑的濃度會影響離子型化合物組分的保存時間。帶有和離子對試劑相反電荷的分析物的保存時間會縮短，帶同樣電荷的會延長。中性化合物幾乎不受影響。在低濃度情況下，比如5mM/L，樣品和離子對試劑互相作用（競爭吸附），保存時間隨離子對試劑濃度的變化呈比例變化，在高濃度情況下，比如10mM/L左右，吸附劑的表面的離子對試劑呈飽和狀態(tài)，此時離子對試劑濃度的變化不會導(dǎo)致分析物保存時間的改變。在開發(fā)方法的時候應(yīng)當(dāng)考慮到這點。假如想要你的方法對某一變量不敏感的話可以這樣做。正相色譜的保存時間對流動相中的極性成分非常敏感。任何情況下水都是一個麻煩。不同數(shù)量的水導(dǎo)致不同的保存時間。有一個竅門是使用半飽和水的非極性溶劑比如正己烷和二氯甲烷來避免這個問題。使用方法是這樣，取一定體積的溶劑，加入一些水，攪拌使水呈飽和狀態(tài)，混合該水飽和溶劑和等體積的不含水的溶劑。該過程可使含水的非極性溶劑得到非常好的重現(xiàn)性。同樣也可以防止保存時間的漂移，下面將具體介紹。3保存時間漂移問：我的色譜峰保存時間發(fā)生漂移，會是什么因素呢？答：這個問題很故意思。因素有很多，讓我們一個一個來看。人們通常認(rèn)為保存時間漂移是平衡的問題。假如你是做正像色譜用純硅膠柱的話就很有也許是這個問題。正像色譜的保存時間對吸附在硅膠表面的水的含量是非常敏感的，所以流動相中溶有水的話，保存時間就會漂移。由于水在正己烷或二氯甲烷等溶劑中的溶解性非常低，所以柱子要很長時間才干平衡好。我曾碰到過一個例子，用非常純的正己烷平衡一個星期后保存時間還是漂移。所以我建議避免使用非常純的試劑。通常使硅膠達(dá)成水平衡的做法是使用半飽和水的試劑。制備方法是一體積的水飽和的疏水試劑：一體積的純試劑混合。這個方法可以大大縮短平衡的時間。在反相色譜中，通常不久就可以平衡的。只需要幾個（5-10）柱體積的流動相就可以。當(dāng)然并不是所有情況都這樣。一個典型的例外就是具有離子對試劑的離子對色譜。離子對試劑的使用量一般是2-5mmol/L或更少。它們吸附在反相鍵和相表面，表面濃度在0.5-2μmol/m2。鍵和相的比表面積為330m2/g，一根4.6mm*250mm的柱子具有3g的鍵和相，其表面積達(dá)成1000m2。要1L的2mmol/L的離子對試劑才干平衡好柱子。當(dāng)然這只是極限的情況，但是一般用幾百mL平衡柱子也不少見的。不要把用過離子對試劑的柱子換成有機(jī)相保存過夜，由于換溶劑的過程中離子對試劑被洗脫下來，而再平衡又需要很長時間。問：這些現(xiàn)象都有一個共同點：流動相中具有低濃度的強(qiáng)吸取的物質(zhì)。這就是導(dǎo)致保存時間漂移的普遍因素嗎？答：是的。其他的沒這么普遍。但是強(qiáng)吸取的物質(zhì)也也許來自樣品。這種情況下強(qiáng)吸取的物質(zhì)會隨著進(jìn)樣的增長而累積，從而導(dǎo)致色譜柱化學(xué)性質(zhì)的改變。樣品中賦形劑的吸取就是一個例子。通過觀測保存時間改變的比率可以判斷污染物是來自于流動相還是樣品中。下面來做個實驗：1反復(fù)進(jìn)樣幾次，如：反復(fù)進(jìn)4次，每次運營1小時。2不進(jìn)樣，泵入相同時間的流動相3反復(fù)第一步4將保存時間作圖A：相對于時間B：相對于進(jìn)樣次數(shù)假如第一張圖譜呈平滑的曲線，就是流動相中攜帶有污染物。假如第二張圖呈平滑的曲線，樣品就是污染物的來源。問：尚有其他導(dǎo)致保存時間漂移的因素嗎？答：有的。也有也許流動向組分隨著時間而變化的。你假如不是使用現(xiàn)在帶有在線混合能力的儀器的話，將會發(fā)現(xiàn)流動相的組分在慢慢的揮發(fā)。特別是在用氦氣脫氣的時候更加明顯，所以應(yīng)當(dāng)將氦氣的流速控制到最小。一個經(jīng)常被低估的因素是鍵和相的水解。生產(chǎn)廠家通常規(guī)定一個pH范圍，超過這個范圍鍵和相救不穩(wěn)定了。這個范圍通常是2-8或9。盡管如此，還是要小心對待這些極限條件的，分界線不是非常明顯的。水解通常還取決于其他條件的，比如溫度和有機(jī)溶劑，在這個pH范圍之類也有緩慢的水解的。鍵和相在中檔pH條件下是最穩(wěn)定的，pH3-5，低溫。等度色譜條件優(yōu)于梯度。當(dāng)然水解的確也在等度中發(fā)生，鍵和相通常會自身吸附，處在一個自身平衡的狀態(tài)。但是在梯度或清洗柱子的時候，使用到高濃度的有機(jī)溶劑時，自身平衡被打破，水解的鍵和相就被沖出了柱子。問：我會記住這些的。溫度的改變會導(dǎo)致保存時間漂移嗎？答：是的，溫度也通常被考慮到的。假如你讓儀器自動進(jìn)樣過夜或過周末，就會發(fā)現(xiàn)保存時間隨著實驗室溫度的改變而產(chǎn)生漂移。在許多地方，為了節(jié)能在晚上或周末室溫會設(shè)立到不同的溫度。按常理來說，室溫每改變1℃，保存時間改變1%-2%。聯(lián)系柱壓的增長導(dǎo)致保存時間漂移的現(xiàn)象。柱壓增長也許是因柱子污染物導(dǎo)致的，但是即使是過濾頭堵塞都也許導(dǎo)致保存時間的改變。壓力會推動流動相通過過濾頭，該過程中的摩擦?xí)訜崃鲃酉?。這種溫度的增長就會導(dǎo)致保存時間的變化。此外尚有一些導(dǎo)致保存時間漂移的因素，但是都非常少見。使用高覆蓋率的鍵和C18末端完全封口的色譜柱在少于一定比例有機(jī)溶劑的流動相中因不能完全潤濕會導(dǎo)致平衡很慢。這將會使流動相和固定相失去接觸而導(dǎo)致“疏水坍塌”，即固定相表面一些區(qū)域因鍵和相的自我吸取而導(dǎo)致與樣品的交互作用減少。及時跑幾個柱體積的有機(jī)溶劑就可以再生柱子了，最佳是使用流動相中的有機(jī)修飾劑（？）。這種現(xiàn)象在不是末端鍵和的色譜柱中很少或幾乎沒有碰到。4不同色譜柱和不同批次之間的重現(xiàn)性問：我要開始開發(fā)一個新的HPLC方法。驗證之后，該方法將轉(zhuǎn)道QC實驗室并將使用許數(shù)年。我緊張該方法的長期的反復(fù)性，特別是柱子的長期反復(fù)性。如何才干保證好的反復(fù)性呢？答：一方面，我要表揚(yáng)你在開始做這個方法的時候就能考慮到這個方面。假如可以預(yù)料到該方法將要使用好幾年，在選擇柱子方面就要做些功課。要想使柱子在該方法的可預(yù)見的合用期內(nèi)可資使用，就要選擇一些大的生產(chǎn)廠家。此外，要選擇一種標(biāo)準(zhǔn)的表面化學(xué)物質(zhì)-比如C18或C8-而不是那些新奇的或很少使用的。換句話說，柱子的選擇要保守點。下一個標(biāo)準(zhǔn)才是柱子的反復(fù)性，假如你或你的同事以前用一根柱子有很好的反復(fù)性，這是一個很好的起點。同時也要考慮生產(chǎn)商提供的信息。近來有的廠家開始印刷他們的說明和不同批次的反復(fù)性實驗的結(jié)果。你可以從廠家得到這些信息然后細(xì)心對照。問:我該從這些信息中尋找什么呢？答：讓我往后回一點，解釋一下不同柱子和批次之間反復(fù)性的不同方面。下面，就說一下反相填料，由于他們更加普遍。假如你用同一批填料的不同柱子，將會得到不同的踏板數(shù)（峰寬），不同的柱壓，不同的保存時間。保存時間與填料密度和柱體積呈比例改變，而柱體積則取決于柱子的內(nèi)徑。這個改變對你的方法應(yīng)當(dāng)是沒什么影響的，由于所有峰的保存時間都呈比列的改變，而分離度還是沒變。這個因素導(dǎo)致的保存時間變化的RSD通常在3%左右，但是假如生產(chǎn)商對柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子踏板數(shù)的變化會影響方法，特別是做雙峰的時候，它們很少能達(dá)成基線分離的。盡管2-3%的踏板數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差已經(jīng)可以達(dá)成，但通常還是在+/-10%，記住踏板數(shù)是個平方數(shù)，分離度僅僅取決于踏板數(shù)的根。所以踏板數(shù)2%的偏差相稱于峰寬1%的偏差。你要確認(rèn)一下柱子的廠家是有踏板數(shù)的上下限，還是只有一個下限，上下限都有比較讓人滿意。同一裝填程序的柱子其柱壓的反復(fù)性是相稱好的，同一批次變化應(yīng)不超過+/-5%。問：那么批次之間的反復(fù)性怎么樣呢？答：假如你注意一下批次間的色譜參數(shù)，你會發(fā)現(xiàn)同參數(shù)會不同，更重要的是批次間分離的選擇性也會改變。就是說峰的相對保存會改變，比如他們在色譜圖中的相對位置，這對你方法的擬定性是不利的這種改變是你要盡量避免的，所以你要從廠家那里得到一些消息，他們是怎么保證批次之間反復(fù)性的，這涉及一些物理，化學(xué)，色譜方面的測試。在物理測試中，最重要的一項是裝填的表面積，該項參數(shù)的變化會直接導(dǎo)致保存時間的變化。所以你要知道廠家認(rèn)可的批次間表面積改變的幅度是多少。通常情況下幅度是+/-10%，但是+/-5%也是可以達(dá)成的。化學(xué)方面的參數(shù)最重要的是鍵合相的表面覆蓋率。通常用多少umol/m2表達(dá)。許多廠家并沒有直接給出這個參數(shù)，而只說明了C的百分含量。我們希望看到的這個代替性的說明以及一個緊湊的幅度，通常是+/-10%，低于+/-4%的也可以達(dá)成。最后你要知道廠家的色譜反復(fù)性測試。通常色譜柱會附帶一張色譜圖，檢測的是一些簡樸的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是這不是一個好的批次間反復(fù)性測試。由于這些中性疏水化合物的相對保存反復(fù)性相稱好，對裝填中表面覆蓋率的改變是相稱不敏感的。好的批次間反復(fù)性測試還應(yīng)在混合物中添加強(qiáng)堿化合物。在精心設(shè)計的測試中，精選的堿性化合物重要與殘余硅羥基作用，而中性化合物則重要與鍵合相作用。只有具有2種化合物的反復(fù)性測試才是讓人信服的。假如一個廠家是這樣測試的并且有好的反復(fù)性，那么他的柱子會更加讓人放心。問：我不知道廠家的測試與我的化合物的檢測有什么聯(lián)系，我應(yīng)當(dāng)如何在我的檢測中保證一個好的批次間反復(fù)性呢？答：你說的很對：上面的消息只能讓你有一個比較大的機(jī)會保證反復(fù)性。但最后必須用你自己的檢測來做反復(fù)性測試。有些廠家提供一整套的設(shè)備涉及不同裝填批次的柱子來做這個測試，此外有的廠家則按規(guī)定提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的東西。同一裝填批次的色譜柱是沒有用的，你需要的是用不同鍵和反映裝填的柱子。假如同一批次是不同天內(nèi)裝填，然后色譜柱編號又不同的時候的時候，廠家也許自己也會迷糊的。所以你最佳詢問2次，保證廠家給你的是你要的。你也許需要3根不同批次的色譜柱來為你的方法做反復(fù)性測試。假如批次間的改變不影響你的檢測，那么接下來的時間你的方法應(yīng)當(dāng)有一個好的反復(fù)性。5樣品配制問題問：我在樣品配制過程中碰到一些問題。我是用反向吸附劑（reversd-phasesorbent）進(jìn)行固相萃取的。通?；厥章识加?0%或更多，但是有時候只有50%或更低。問題出在哪呢？答：你的問題比較普遍。我發(fā)現(xiàn)回收率低通常是由解決方法導(dǎo)致的。80%的回收率對分析來說也許足夠，但是對方法耐用性來說則不夠?？磥碛幸粋€因素導(dǎo)致樣品不完全回收，損失20%-50%。我們要找到損失的20%-50%到哪里去了。問：ok，我們怎么找？答：有四個方案：1分析物在固相萃取前丟失2分析物在吸附過程中沒有完全吸附3一部分分析物在清洗過程中被洗掉4部分分析物在洗脫過程中仍然留在固相萃取管中要確認(rèn)分析物是不是在吸附過程中穿過了SPE柱，我們只要在第一個SPE柱后面再接一個SPE柱就好了。假如在第二個SPE柱的洗脫液中具有相稱數(shù)量的分析物，那么就知道吸附是不完全的。有幾個因素也許導(dǎo)致不完全吸附。1樣品的濃度太高，假如這樣要用水稀釋樣品（可電離的樣品用緩沖液稀釋）。2確認(rèn)SPE柱是否活化了。反相固相萃取管的活化先走有機(jī)相（甲醇，乙腈等）再用水或緩沖液平衡。然后樣品才干吸附上去。很多人想省掉這些額外的麻煩環(huán)節(jié)，但是為了保證方法的準(zhǔn)確性這是必須的。問：我已經(jīng)按照廠家的建議活化管子了，所以應(yīng)當(dāng)不是這個問題。我喜歡你的加一個管子來核算吸附過程的完整性的建議。我應(yīng)當(dāng)怎么檢查方法的其他環(huán)節(jié)呢？答：檢查清洗過程，你要收集所有的清洗液，然后用HPLC分析。但是假如清洗過程中有干擾分析物的物質(zhì)也被洗脫下來，那么就不好對清洗液中的分析物進(jìn)行定量分析。這時我們可以通過下面的技術(shù)手段來解決這個問題。把清洗液蒸干，用樣品的配制溶液溶解，再用同樣的方法萃取一遍，假如在這個洗脫液中能檢測到另一比例的分析物，那就知道了在清洗環(huán)節(jié)中有一部分的分析物被洗脫了。另一個方法是把標(biāo)準(zhǔn)品按樣品解決方法走一遍。但該方法不夠嚴(yán)謹(jǐn)，由于基質(zhì)會影響分析物的行為。問：這些建議挺好的。我怎么分析殘留在萃取管中的分析物呢？答：在開始的洗脫環(huán)節(jié)后你要用大量的洗脫液沖洗萃取管，這樣也許洗脫更多的分析物。經(jīng)常要用到洗脫能力更強(qiáng)的洗脫液?？紤]一下這部分分析物為什么會有強(qiáng)殘留。是與殘留硅羥基作用嗎？--改變洗脫液的pH或緩沖能力。是因疏水作用嗎？--增長有機(jī)相的比例或改用洗脫能力更強(qiáng)的有機(jī)相（如用乙腈取代甲醇）。是通過氫鍵與殘留硅羥基作用嗎？--在乙腈或四氫呋喃中添加甲醇或許有所幫助。問：OK，假如我在所有的環(huán)節(jié)中都沒有發(fā)現(xiàn)丟失的比例，那么是否可以排除固相萃取過程的問題呢？答：是的。我們就要探索是否在其他配置過程丟失的。也許是強(qiáng)烈吸附在樣品瓶上。強(qiáng)疏水的分析物也許會吸附道聚乙烯瓶的壁上。強(qiáng)酸物質(zhì)也許與玻璃瓶表面的硅羥基結(jié)合。分析物也也許吸附在基質(zhì)的固定相上，或者與基質(zhì)的其他組分結(jié)合（如蛋白質(zhì)）。這些情況下更難分離。綜上，要使回收率盡量接近100%，建立方法的時候要有很好耐用性。盡管環(huán)境的影響也許導(dǎo)致回收率反復(fù)性不好，但是其幾率要低于耐用性不好的方法。假如你能在開始的時候就能達(dá)成好的回收率，那么洗脫液組分或裝填物質(zhì)的較小變化都不會影響你的方法。唯一也許改變回收率的是SPE柱基床的質(zhì)量。假如基床上有個空隙，流速將不均勻。分析物也許較早的就沖出管子。你可以粗略的觀測下你的設(shè)備避免這個問題?？障秾Ψ椒ǖ挠绊懯欠浅Ｃ黠@的。6峰形拖尾因素Q：如何才干避免拖尾?A：一方面要找到拖尾產(chǎn)生的因素，拖尾通常是由于柱外接口體積擴(kuò)大，柱床污染以及被分析物與鍵合活性位點互相作用而產(chǎn)生的．顯然要解決問題必須對癥下藥．Q：如何檢查拖尾的因素？A：一方面要仔細(xì)觀測色譜圖，在不知道樣品的性質(zhì)和色譜條件的情況下，色譜圖可以提供很多線索，再借助其余的條件可以驗證基于色譜圖的猜想．第一檢測峰高。假如你使用了紫外檢測器并且峰高在1AUFS（Absorbanceunits,fullscale？），可以猜測是柱子過載了．一般情況下,化合物的extinctioncoefficients是1000．為了確認(rèn)是否真的過量,我們需要知道進(jìn)樣量是多少.通?？讖綖?00埃的全多孔填料的限度為100ug.以上都是一般的經(jīng)驗方法，可以再進(jìn)１／１０濃度的樣品看看峰形是否有改善．Q：好的，但是假如在低濃度情況下仍然有拖尾怎么辦？A：同樣要仔細(xì)觀測色譜圖．假如圖譜中有很多峰，看各個峰形是保持一定的拖尾限度還是隨著時間推移峰形有一致的變化趨勢．假如圖譜中前面的峰比后面的峰拖尾的更厲害，可以考慮柱外效應(yīng)的影響．柱外效應(yīng)對峰的影響與峰寬成反比，所以對前面的峰影響比后面的峰影響大。2種柱外效應(yīng)值得考慮1柱外峰展寬2detectortime-constant在連接管路，進(jìn)樣器和檢測器的峰展寬可導(dǎo)致色譜圖中前面峰的拖尾。你有沒有使用與柱子不配套的管路連接到儀器上？最近有沒有更換系統(tǒng)的管路。假如換了你要查看下管路的類型。（進(jìn)樣器到檢測器應(yīng)使用內(nèi)徑為9/1000’’的管路，1ˊ=0.3048m1〞=25.4mm）此外要檢查所有連接管路是否都合適。通常柱外效應(yīng)產(chǎn)生的因素是不同廠家使用了不同長度的管路來連接箍頭和柱子。在5um色譜柱中，15ul的柱外峰展寬的差別會導(dǎo)致峰形產(chǎn)生3ml的明顯改變。大的constant-time也能導(dǎo)致前面的峰比后面的峰更加拖尾。默認(rèn)的時間是1s，假如用的是5um的色譜柱，也許有2-3min的失真。時間越長影響越大。假如色譜圖中所有峰的拖尾限度大約一致，那么有2個也許：1柱床損壞2圖譜中所有樣品組分化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，拖尾是因化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的第一種情況，要檢查柱子是否損壞，按標(biāo)準(zhǔn)條件最佳是按廠家推薦的方法做。通常柱子也許是吸附了一些污染物或顆粒，用適當(dāng)?shù)娜軇┛梢韵疵摰簦ㄈ绶聪嘀肨HF），但是假如是柱床改變了就不也許修復(fù)了。第二種情況，化學(xué)作用也許是拖尾的因素。假如色譜圖中只有一些峰是拖尾的而此外的峰形是好的，那么很有也許是化學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致的拖尾。問：這些化學(xué)效應(yīng)是什么東西？請幫我說明一下!答：化學(xué)效應(yīng)有好幾種，最常見的就是分析物與不均一的活性表面的互相作用。典型的就是強(qiáng)堿在反相柱中的拖尾。這種類型的化合物能與填料表面的殘留硅羥基和鍵合相發(fā)生強(qiáng)烈的作用。假如硅羥基基團(tuán)在填料表面形成一個不均一的簇落，拖尾就發(fā)生了。問：我怎么樣才干排除由化學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致的拖尾呢？答：一方面，要考慮一根不會產(chǎn)生這種現(xiàn)象的柱子。一些新設(shè)計的反相填料可以盡量的減少堿基的拖尾。第二，調(diào)節(jié)流動相的pH或者在流動相中添加有機(jī)基團(tuán)與分析物競爭結(jié)合活性位點都能改善拖尾。這是由于硅羥基親和作用重要是離子互換反映。在酸性pH下，很少的硅羥基帶負(fù)電，所以帶正電的分析物就不怎么拖尾。三乙胺經(jīng)常用作競爭基團(tuán)。但是在所有的競爭基團(tuán)中，疏水性越強(qiáng)作用越好，例如正辛烷和四丁基銨鹽。假如硅羥基親和作用不是離子互換而是氫鍵結(jié)合，可以通過改變?nèi)芤旱臍滏I結(jié)合性能來改善峰形。例如作為流動相的有機(jī)改善劑來說甲醇比乙腈的作用更好。同樣的情況也可以在正相色譜中碰到?？梢圆捎猛瑯拥拇胧﹣砜酥仆衔?。在流動相中添加乙醇或乙腈作為極性改善劑能對拖尾產(chǎn)生明顯的改變。此外尚有一些拖尾的因素，但碰到的比較少。樣品污染物吸附在柱頭篩板或進(jìn)樣器中也有碰到的。也有也許分析物在色譜分析過程中發(fā)生化學(xué)變化，如分析物降解或不同分子形式之間緩慢平衡等。7正相色譜問：我總是用反相色譜而盡量避免正相色譜。由于我的同事和我說正相比反相難。是真的嗎？答：很不幸，這種說法的確有一定的對的性。但是只要掌握了對的的知識就可以解決一些困難了。最常見的問題是保存時間的改變。這種改變通常是由于流動相中的一些強(qiáng)極性的物質(zhì)導(dǎo)致的，特別是水分。也有也許是甲醇和乙腈，它們通常被加入到流動相中以控制保存和選擇性。水分總是或多或少的存在與所有的有機(jī)溶劑中，含量通常是ppm級。表1是正相使用的非極性溶劑中水的溶解性。所以假如沒有通過特別的前解決的話，流動相中的水分含量就會差異很大。但是使用無水溶劑也不可取，由于要花費很長時間（報道說要數(shù)天）來使柱子達(dá)成平衡。具有飽和水的溶劑也不行，水分會聚集在填料孔中，色譜柱就變得不均一了。所以我們要的是一個水分含量適中并且可控的溶劑。一個在用的可反復(fù)的辦法是制成水半飽和的溶劑。方法很簡樸。把溶劑兩等分，一份制成水飽和的。大約是加1-2mL的水到500mL的流動相中，然后攪拌半小時，除去多余的水，兩份再混合。這就把本來的無水溶劑變成水半飽和的溶劑了。表1溶劑中水的溶解性溶劑百分含量（%W/W）溫度（℃）正己烷（Hexane）0.011120庚烷（Heptane）0.009125異辛烷（Isooctane）0.005520甲苯（Toluene）0.033425二氯甲烷（Dichloromethane）0.198025氯仿/三氯甲烷（Chloroform）0.072023四氯化碳（Carbontetrachloride）0.010024鄰二氯苯（o-Dichlorobenzene）0.309025乙酸乙酯（Ethylacetate）2.940025乙酸丁酯（Butylacetate）1.860020二乙醚（Diethylether）1.468025甲基叔丁基醚（Methyl-t-butylether）1.5000用半飽和流動相柱子能比無水流動相更快的平衡，但是仍然需要數(shù)小時。所以最佳是一根柱子專用一種流動相，這樣幾分鐘就可以平衡了。顯然流動相中極性改善劑也要好好控制。例如，假如用甲醇，那么只需要用很少的量（＜0.5%），并且稍微改變一點都會引起保存的很大變化。這種情況使用極性小點溶劑如異丙醇或乙醇會比較好，或者也可以不使用乙醇而采用低極性的醚類或酯類。這些都可以顯著的影響分離的選擇性。問：我注意到你在正相色譜中更多的關(guān)注流動相的組分。能說說固定相嗎？固定相之間有優(yōu)劣之分嗎？答：的確是有分別的。純硅膠和氧化鋁是親水性很強(qiáng)的，所以對流動相中的水分非常敏感。而接有極性鍵合相的，如CN-，二羥基-和氨基-等則不那么敏感?；诒４鏁r間的反復(fù)性，開發(fā)方法的時候更多的是采用后者。這些鍵和相的有些特性必須了解。例如，在通常的正相條件下，氨基柱表面的初級氨基基團(tuán)（α位？）很容易和醛基或酮基形成希弗堿/亞胺（Schiff-base/imine），所以氨基柱不能用來分析具有醛基或酮基的樣品。氰基柱在非極性溶液中非常耐用，但是一旦接觸中性的溶劑如純乙腈，THF或甲醇等就會發(fā)生柱床坍塌。這種情況也許在沖洗樣品碎片堆積在柱子中產(chǎn)生的污染時碰到。按我們的經(jīng)驗，在沖洗的過程中最佳保持恒定的高流速。低流速或用這些溶劑保存柱子更也許導(dǎo)致柱床坍塌。氨基柱假如接觸水溶液會有很大變化。填料空隙中高密度的氨基基團(tuán)會相成一個強(qiáng)堿性環(huán)境，從而導(dǎo)致鍵合相水解。所以再用回正相流動相后，千萬不要奇怪色譜柱性能的明顯改變。這些極性鍵和柱和純硅膠柱，氧化鋁柱同樣都是非常通用的，所以不能說誰比誰好。這些柱子都有特異的選擇性，彼此都不同。純硅膠柱對堿性物質(zhì)有強(qiáng)保存，氨基柱對酸性物質(zhì)有強(qiáng)保存，氰基柱和二羥基柱則適合中性物質(zhì)。二羥基極性比氰基更強(qiáng)，所以通常保存更好。同反相柱同樣，不同品牌的同一鍵合相的柱子也有著明顯的差異。除了硅膠不同，鍵和技術(shù)以及末端封尾技術(shù)都不同樣。單官能基，雙官能基或三官能基的硅烷都有采用的。假如采用了多官能團(tuán)的硅烷，那么就要用不同的覆膜技術(shù)從而導(dǎo)致單層覆膜或多聚覆膜。氰基柱不一定是末端封尾的，氨基柱和二羥基柱通常沒有末端封尾。所以和反相柱同樣，品牌A和品牌B的分離表現(xiàn)是不同樣的。參考書籍：TechniquesofChemistry,Vol.II,OrganicSolvents,PhysicalPropertiesandMethodsofPurification,ThirdEdition(1970),JohnA.RiddickandWilliamB.Bunger,Wiley-InterscienceMerckIndex,EleventhEdition(1989),Merck&Co.,Inc.8系統(tǒng)體積，死體積，滯后體積（DwellVolume）問：我經(jīng)常碰到一些名詞如系統(tǒng)峰展寬，系統(tǒng)體積，死體積，滯后體積等等，能不能給我解釋一下這些名詞？答：非常樂意。當(dāng)我們說到這些名詞的時候，我們要清楚的定義他們。我們將會看到，他們非常的不同并且能影響色譜分離的不同部分。從死體積開始，也叫做柱外體積，這樣叫也許清楚一點。他是色譜系統(tǒng)中進(jìn)樣點到檢測點的體積，但是要除去色譜柱填料的體積。他涉及進(jìn)樣體積，進(jìn)樣針體積（injectionvolume和thevolumeofinjector的區(qū)別？），柱前和柱后連接管路的體積，柱頭體積（涉及濾片）和檢測器的體積。精確點說，涉及一半的進(jìn)樣體積和一半的檢測器體積。我們關(guān)注柱外體積是由于它會導(dǎo)致柱外峰展寬。峰展寬即峰在流過柱外體積的后變的更寬了。這也許會破壞柱子的分離。我們盡量減少柱外峰展寬。問：我們怎么測量柱外體積和柱外峰展寬？答：要完整的測量柱外體積和柱外峰展寬需要用到特殊的設(shè)備。這是由于它包含了柱頭和濾片的體積，對用戶來說這難以測量。我們只能信任柱子廠家做了充足的工作使柱外體積降到最小。我們?nèi)菀诇y量的是色譜系統(tǒng)中的柱外體積。我們只要用一個0死體積的接頭代替柱子，然后進(jìn)小量樣品記錄圖譜，就可以知道了。圖1是一個例子。在這張圖中我們可以測定柱外體積和柱外峰展寬。柱外體積等于進(jìn)樣點到峰中線的距離，我們只要計算峰的起點就可以測定柱外體積了。但是我們的結(jié)果不是非常的精確，并且不能簡樸的把進(jìn)樣點到峰最高點的距離當(dāng)作是系統(tǒng)的死時間。圖1我們可以用峰的相對偏差來衡量系統(tǒng)峰展寬。峰的相對偏差可以通過峰尾（？secondmomentofthepeak）時間計算出來。一個容易的方法是測量峰寬。由于峰是高度對稱的，所以測量越靠近基線的峰寬結(jié)果越真實。例如4.4%峰高處的峰寬相稱于5個相對偏差。問：OK，我應(yīng)當(dāng)用什么樣品和流動相來檢測呢？答：流動相用你平常分析的就可以，樣品要用標(biāo)準(zhǔn)品。但是一般標(biāo)準(zhǔn)品濃度比較大，所以要稀釋以獲得小的柱外峰展寬。這樣做你就能得到一個實際色譜條件下的柱外峰展寬。此外你也可以用一個通常的方法來標(biāo)準(zhǔn)化這個測量過程。這有個缺陷就是你也許會錯過一些你在實際分析過程中碰到的問題。我?guī)啄昵芭龅竭^一個例子，樣品與進(jìn)樣器強(qiáng)烈的作用。盡管我們找遍了所有能導(dǎo)致峰展寬的因素，但是在標(biāo)準(zhǔn)化的測試中還是沒有解決。后來用不同的樣品和流動相才找到因素。問：這些是關(guān)于柱外體積和柱外峰展寬的，那系統(tǒng)體積和滯后體積呢？答：我不太喜歡“系統(tǒng)體積”這種說法，比較模糊。你也許會碰到系統(tǒng)死體積或系統(tǒng)滯后體積。我們要拋棄系統(tǒng)體積這種說法，代之以柱外體積和梯度滯后體積。后者也被叫做梯度延遲體積。它是指梯度混合點到柱頭的體積（它也存在于等度色譜中，但在那里不重要）。梯度滯后體積涉及梯度混合器體積，接泵的管路體積，泵頭（？pumphead）和單向閥的體積，泵與進(jìn)樣器之間管路體積，進(jìn)樣器體積，進(jìn)樣器到柱子管路的體積?？矗谶@些組件中體積挺多的。當(dāng)你開始運營一個梯度時，需要花費一些時間把這些體積排掉再讓梯度進(jìn)入柱子。在這個時間內(nèi)，色譜峰是在先前的流動相中做等度遷移。假如不同儀器之間的梯度滯后時間差別足夠大，這個等度遷移將足以影響色譜圖，特別是前部分。另一個惱人的影響是你的實際分離也許會被明顯推遲。假如系統(tǒng)有2mL的延遲體積，梯度流速為200uL/min，梯度將需要10min才干到達(dá)柱子。你的分析也因而推遲了10min。問：我應(yīng)當(dāng)怎么測量滯后體積？答：同樣，卸掉柱子，接二通。用甲醇和10mg/L的對羥基苯甲酸丙酯甲醇溶液跑臺階梯度，接紫外檢測器。你會得到一個S形的圖。然后測量從梯度開始到臺階一半高的時間之差。把這個時間乘上流速就是梯度延遲或滯后體積。問：有沒有什么文獻(xiàn)有這些定義的？答：許多教科書都有一些章節(jié)定義這些色譜名詞的。權(quán)威的是國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會分析化學(xué)協(xié)會分析命名委員會。我確信在他們最新的正規(guī)命名出版在理論與應(yīng)用化學(xué)中，Vol.65,No.4,pp.819-872,1993.不幸的是不是所有的名詞都有解釋，比如滯后體積就沒有收錄，而有些定義還是比較模糊。9梯度方法轉(zhuǎn)移問：我開發(fā)的一個方法在我的系統(tǒng)上反復(fù)性非常好，但是在其他系統(tǒng)上就不同樣了，怎么回事？答：有時候換色譜系統(tǒng)時梯度方法會出現(xiàn)一些問題。除非系統(tǒng)完全同樣，否則保存時間總有些變化。通常這個時間的變化都在分離度的范圍之內(nèi)，忽略它，方法還是可以用的。此外，假如適當(dāng)了解潛在的因素，可以調(diào)節(jié)梯度在不同的色譜系統(tǒng)中得到相同的效果。另一個涉及到這個問題的是梯度滯后體積。它是從梯度混合處到柱頭的體積。當(dāng)你進(jìn)樣開始分析后，梯度并沒有到達(dá)柱頭，還要等滯后體積排空后才到。這就是說樣品在開始一段時間是等度遷移的。由于不同系統(tǒng)的滯后體積是不同的，所以保存時間就不同樣了，有時候還是影響到分離度。另一個因素是梯度自身，由系統(tǒng)與系統(tǒng)之間的組分差異導(dǎo)致。對于現(xiàn)在大部分的色譜廠家來說這個問題都不是很嚴(yán)重。但通常，在輸送等比例的流動相（50%A和50%B）時精確度最高，比例相差大（5%A或95%A）時精確度就會受損。問：怎么知道我是哪種情況呢？答：最簡樸的做法是比較一下兩個系統(tǒng)的梯度。卸掉柱子，接二通。（在梯度的B溶液后接一個紫外檢測器）。假如用的是反向色譜，可以在B溶液中加10mg/L的對羥基苯甲酸丙酯。兩個系統(tǒng)都開始運營梯度，記錄基線。然后比較一下兩張圖譜。你要找到梯度開始的位置，測量梯度圖譜。假如梯度是線性的，只要測量梯度的斜率就可以了。很也許你會發(fā)現(xiàn)兩臺儀器的梯度開始時間不同樣，圖譜非常類似，梯度結(jié)束時間有一定的改變。這種情況就是說兩臺儀器的梯度滯后體積不同樣。問：假如是這種情況，有沒有簡樸的方法抵消滯后體積的差異呢？答：有一個辦法大部分時候可以采用。假如新系統(tǒng)的梯度滯后體積小于轉(zhuǎn)移前系統(tǒng)的體積，可以在梯度開始加一段等度。假如新系統(tǒng)滯后體積大，這種情況就比較困難。原則上你可以先開梯度，延后一段時間進(jìn)樣，這段時間要與兩臺儀器的滯后時間差一致。但在自動系統(tǒng)中就不能這么做，自動系統(tǒng)中是進(jìn)樣觸發(fā)梯度開始的，這時候也許需要手動基線歸零或重新開發(fā)方法。問：在我花費時間開發(fā)方法后碰到這種情況可真不樂見啊。我以后該怎么做來避免呢？答：你可以在最終使用的儀器上開發(fā)方法。這也許需要一些預(yù)見與計劃，但通常還是可行的。你需要做的是了解新系統(tǒng)的性能，要知道系統(tǒng)的兩個基本情況：梯度滯后體積和比例精確性。你可以在同一個實驗里得到這兩個數(shù)據(jù)：如前所述，在B溶液后加紫外檢測器，設(shè)立一個多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從0%變到100%，流速與平常同樣，應(yīng)當(dāng)是1mL/min吧。每段梯度大約保持5min。然后接二通運營梯度，記錄圖譜。每段梯度設(shè)立的時間與實際發(fā)生的梯度時間之差就是梯度延遲時間。階層的高度可以用來測量流動相比例。這些階層也許有點模糊，那是由系統(tǒng)中混合體積導(dǎo)致的。檢測完系統(tǒng)，就可以按照它的性能來設(shè)計方法了。正如我前面提到的，最大的問題是梯度滯后體積。假如你知道新儀器的滯后體積比開發(fā)方法的儀器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別。假如目的系統(tǒng)滯后體積小，你就要在轉(zhuǎn)移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間。假如比例差別是在梯度運營中間出現(xiàn)的，相信你也可以通過調(diào)節(jié)梯度圖譜來抵消這種差別，但是我歷來沒有碰到過需要這么做的情況。這個討論是假設(shè)柱子已經(jīng)用初始流動相充足平衡了。有時我會碰到這樣一些情況，在平常分析中，梯度變化不久，而柱子沒有用初始流動相平衡好。這樣第一針時總是與后面的不同樣。這也許是加快方法的缺陷，但是假如轉(zhuǎn)移到有不同樣滯后體積的系統(tǒng)時，也許就會產(chǎn)生一些問題。10系統(tǒng)堵塞問：我的系統(tǒng)壓力比它應(yīng)當(dāng)?shù)膲毫Ω吆芏?，是什么因素？答：一方面，讓我們檢查一下你的前提，你怎么知道壓力應(yīng)當(dāng)是多少？問：之前同樣的柱子，同樣的流動相，同樣溫度壓力只有2023PSI?，F(xiàn)在是兩部了。我把泵壓的上限設(shè)為4000PSI，泵停了。答：很好你有以前的參考數(shù)據(jù)，我們可以從這里開始排查故障。壓力變大，因素很多。一方面，流動相的粘度也許不對。另一方面，系統(tǒng)某個地方也許堵了。后者比較常見，但是在我們拆系統(tǒng)前，先檢查下其他的也許。你擬定你的流動相是對的？假如用的是自動混合，你溶液有沒有放錯？例如把甲醇和乙腈弄混了（由于兩者與水混合液的粘度差異很容易導(dǎo)致壓力不同）。假如使用了柱溫箱加熱，確認(rèn)一下它有沒有工作。溫度每變10℃粘度變化25%。所以假如你本來要開60℃，但是柱溫箱沒有工作，這樣壓力就會翻倍了。問：OK，這個很容易檢查，其它尚有哪些要檢查的？答：我經(jīng)常問這個問題，壓力變大是在長期分析中慢慢出現(xiàn)還是忽然出現(xiàn)的。假如是忽然出現(xiàn)的，也許是有些錯誤發(fā)生了。讓我們來檢查一些東西，從簡樸的開始：柱子填料的顆粒大小對不對？柱子壓力與顆粒大小的平方成比例變化。假如你用5um的柱子代替10um的柱子，就可以解釋壓力的增長了。不是這種情況，那么就有地方堵住了。一方面卸掉柱子接二通，保護(hù)柱和柱前過濾器不要下下來。我們要檢查的一個也許是流動相不相容，假如接分析柱在后面的操作中也許對其有損。不連柱子，檢查壓力，假如尚有1500多psi，那么是其他地方堵了，柱子是好的。我們可以在流路上一個一個斷開看哪里壓力最大。通常換一個部件比清洗更有效，但我們不是隨時都有備用的，所以可以考慮清洗。假如我們知道要除掉的是什么東西，那么就很容易知道怎么洗。假設(shè)是濾頭堵了，也許是上一次的流動相沒有排完，與新的流動相不相溶導(dǎo)致的。也許是緩沖鹽析出了。這種情況只要用能溶解析出鹽的溶液沖洗堵塞部位一段時間就可以了。假如是分析柱或保護(hù)柱忽然堵塞，就要檢查柱子的保存溶劑。保存溶劑也許與流動相不相溶而導(dǎo)致緩沖鹽析出?；蛘咧佑煤}的流動相保存，而柱塞松動，導(dǎo)致流動相部分蒸發(fā)，有鹽析出。這時要用能溶解該鹽的流動相低流速沖洗柱子來恢復(fù)活性。問：我的情況是在運營序列中間忽然出現(xiàn)的，這是怎么回事呢？答：這種情況也許是系統(tǒng)的某部分被積累的小顆粒堵塞了。小顆粒也許來源于密封圈或樣品，也許是樣品不溶于流動相或者樣品強(qiáng)烈的吸附在保護(hù)柱或分析柱（沒用保護(hù)柱）上。這通常是樣品中大分子量的組分，而你沒有去除或者只是部分去除掉了，如血清樣品中的蛋白質(zhì)，制劑中的輔料或食品中的高分量組分。假如你用了柱前過濾器和保護(hù)柱，讓我們依次下下來，測量系統(tǒng)壓力。這樣，我們應(yīng)當(dāng)可以不久找到堵塞的部位。假如是保護(hù)柱和柱前過濾器堵了，最佳更換掉。它們就是用來保護(hù)分析柱的。想要清洗它們接著使用是劃不來的，由于下次它們也許就不能擋住那些污染物了，而柱子就要弄壞了。假如是分析柱堵了，最佳是清理一下。但是最佳的挽救是防止，考慮加個柱前過濾器，最佳加個保護(hù)柱。假如問題來自樣品，就要把樣品過濾，或者用固相萃取除掉污染物。假如有備用的柱子濾片，換掉柱頭進(jìn)口的濾片。沒有就把它拿下來，超聲清洗。這只對硅膠柱有用，假如是聚合柱（polymericcolumn），它的填料是有內(nèi)壓的，你一拿開濾片填料就會泄漏出來。這時假如手頭有備用的濾片，就要快速的更換并重新封好柱子，假如沒有就不要開聚合柱。假如更換或清洗后壓力沒有減少，那么也許是有東西吸附在填料表面或者滲透到了柱子中間了。這時就要用能溶解或解吸取潛在污染物的溶液低流速沖洗柱子。柱子廠家都有介紹用一系列強(qiáng)度遞增的溶液來完畢這個工作的。對反相柱來說，可以采用如下程序：水，甲醇，THF，二氯甲烷，甲醇再回到水。對正相柱程序的極性相反：二氯甲烷，THF，水，甲醇，二氯甲烷。假如還是沒用，可以考慮反向沖洗柱子。但是到了這個時候最佳拿起電話去訂購一根新柱子。11色譜柱塔板數(shù)問：我運營我的方法檢測柱子的塔板數(shù)是8000，但是廠家的報告書上說有13000，怎么解釋這個差別？A：色譜柱的塔板數(shù)不是不變的。一根柱子的塔板數(shù)和流速，流動相的粘度以及分析物的分子量有關(guān)。儀器也許也會影響檢測，但是我們現(xiàn)在不考慮它。柱子廠家設(shè)立了一個檢測柱子性能的標(biāo)準(zhǔn)方法。反相色譜通常是檢測一些簡樸的疏水化合物，如甲苯，萘或苊，流動相用高比例的有機(jī)相，這樣，流動相的粘度就低。但是大多數(shù)的液相工作者更常碰到極性分析物，這需要高水相的流動相，粘度就變大了。在通常的色譜條件和流速下，粘度增長，塔板數(shù)減少，所以實際檢測的塔板數(shù)比廠家測試的低。問：假如通常條件下檢測的塔板數(shù)比廠家報道的低，是不是廠家在故意誤導(dǎo)消費者呢？答：不是這個意思，這個不是報告的目的。廠家設(shè)計的程序是用來檢測柱子性能的，它能表現(xiàn)色譜柱的最高塔板數(shù)或接近它。這就是為什么色譜柱填料技術(shù)影響最大。所以假如我要檢查填料技術(shù)，就是通過這個來檢查的。問：請再解釋一下為什么塔板數(shù)隨流速，填料變化？怎么變化的？答：所有關(guān)于塔板數(shù)的參數(shù)的變化最后都可以歸因于理論踏板的高度變化，而理論踏板高度取決于理論速率。我會適當(dāng)展開說明的，但是為了深刻的理解還是讓我們先看看色譜教科書是怎么說的。柱子的塔板數(shù)等于柱長L除以理論踏板高度和顆粒直徑大小dp（方程1）柱長和顆粒大小都是擬定的（已知）。理論踏板高度取決于理論速率，定義如下（方程2）等式中u是線速度，Dm是樣品在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)，dp是顆粒直徑大小。大多數(shù)液相的理論速率是3-20之間。理論上有好幾個描述理論踏板高度與理論速率的方程式，在我們討論的流速范圍內(nèi)，它們的結(jié)果都是一致的。所以我們選一個最簡樸的看看，它是基于van-Deemter等式。（方程3）擴(kuò)散系數(shù)是反相條件下從大量數(shù)據(jù)推導(dǎo)出的一個經(jīng)驗數(shù)據(jù)。這個曲線描述了在這個關(guān)系下當(dāng)理論速率等于2.5時有個最小值。初始擴(kuò)散系數(shù)是檢測填料一致性的，因此它涉及到裝填過程。塔板數(shù)與理論速率的關(guān)系如下：（方程4）由于由理論速率決定的等板高度(HETP,Heightequivalentoftheoreticalplate)有一個最小值，所以有理論速率決定的塔板數(shù)有一個最大值。一些計算表白最大塔板數(shù)大約是L/2.3dp。所以我們可以說一根15cm長，5um顆粒半徑的柱子最大塔板數(shù)能有13000就是一根好柱子。差的填料對方程3的第一個系數(shù)影響很大，而對其他的幾乎沒有影響，結(jié)果基本同樣。這就是為什么測試柱子時測的是接近最大塔板數(shù)。現(xiàn)在開始問題的第二個部分，流速對塔板數(shù)的影響。我想用理論速率來代替流速，他們差別不大，由于理論速率同線速度成比例，而線速度同流速成比例，所以塔板數(shù)與流速成比例。在流速非常小和非常大時塔板數(shù)都很低，那么最大塔板數(shù)肯定在中間某個流速。但是在哪呢？正如我們在理論速率的定義方程式2中所見，理論速率涉及分析物在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)。在上面的結(jié)果我們看到，最大塔板數(shù)發(fā)生在理論速率是2-3之間。對于柱子測試經(jīng)常用到的疏水分析物，流動相通常是70/30v/v乙腈/水，5um的色譜柱線速度是1-1.5mm/sec。該線速度下直徑3.9mm的柱子流速是0.5-0.7mL/min，4.6mm的柱子流速是0.7-1mL/min。鑒于該曲線的最小處取決于擴(kuò)散系數(shù)，我們要知道流動相對擴(kuò)散系數(shù)的影響。理論上有些方程有助于我們估算分析物在特定溶液中的擴(kuò)散系數(shù)（如Wilke-Chang方程），但是對現(xiàn)在討論來說我們只要知道擴(kuò)散系數(shù)同流動相的粘度成反比就可以了：（方程5）這表達(dá)最大塔板數(shù)時的理論速率（或流速）隨著粘度的增長而減少。70/30v/v乙腈/水的粘度是0.7cP，50/50v/v甲醇/水的粘度是1.8cP。當(dāng)我們用甲醇/水流動相時，最抱負(fù)的流速就要降到0.2-0.3mL/min（3.9mm，5um柱）或0.3-0.4mL/min（4.6mm，5um柱）。開發(fā)方法的時候要注意這點。擴(kuò)散系數(shù)取決于溶液粘度可以得到一個有趣的側(cè)面推論。我們可以用下面這個常識來估算柱效：當(dāng)流動相組分改變了，假如在不同的流動相中壓力同樣，那么柱子的塔板數(shù)也同樣。一個值得記住的規(guī)則！12柱壓問：我用的柱子是4.6mm*150mm5umC18柱。流動相是50/50的甲醇/pH7的磷酸緩沖液。1.5mL/min的流速時壓力是3000psi，正常嗎？答：稍微有點高，不是很嚴(yán)重。我估計柱子自身應(yīng)當(dāng)有2400psi的壓力，加上連接管路200psi應(yīng)當(dāng)是2600psi的壓力。我想，你的柱子也許稍微有點堵塞了。問：很有也許。我也懷疑堵了，所以問你。你怎么估算2400psi是“估計”的壓力？答：我是通過Kozeny-Carman方程計算出來的。它與所有剛性填料（incompressiblepackings）（如硅膠填料）的液相色譜柱都吻合的很好。Kozeny-Carman方程中壓力與流速F，粘度η，柱長L，柱半徑r和顆粒直徑dp有關(guān)：（方程1）壓力與流速，粘度，柱長成正比，與柱半徑的平方，顆粒直徑的平方成反比。比例因子f取決于空間比例（顆粒間的空間）和填料密度。剛性填料裝好后密度幾乎不變，空間比例就是40%。這根柱子的f因子就是1000左右。問：OK。我算算我上面柱子的壓力。我知道流速，柱長，柱半徑和顆粒直徑。粘度是多少呢？答：純?nèi)軇┑恼扯瓤梢栽谝恍┦謨陨险业健τ诜蔷喓腿芤海╪on-associatingsolvents），可以假設(shè)它們與體積比例成線性變化，從而大約推算出來。對于水性溶液就不能這樣推算。大多數(shù)有機(jī)溶劑和水的混合液有一個最大粘度。常用的混合液粘度如圖1所示。（圖1）圖1：不同比例的水與有機(jī)溶劑混合液的粘度。其中：MeOH=甲醇，MeCN=乙腈，EtOH=乙醇，THF=四氫呋喃。室溫下，50/50的甲醇/水混合液的粘度是1.8cP（=0.018P）。水和低濃度緩沖液的粘度與此相差不大，所以可以用圖中水/甲醇的粘度來代替。那么壓力計算如下：最后一項10*-6是大氣壓轉(zhuǎn)換系數(shù)。不要忘了把流速除以60，單位就是mL/s了。這樣單位就同樣了。把大氣壓轉(zhuǎn)換道psi，乘以14.7。得到結(jié)果是2388psi，相稱于2400psi了。問：受益匪淺?，F(xiàn)在讓我們回到柱子。看起來仿佛有地方堵了，我該怎么做呢？答：最簡樸的是更換入口濾片。這很有希望減少柱壓。事實上你也可以把舊的濾片超聲清洗。假如更換濾片不能減少柱壓，就也許是填料堵了。不管是什么堵在填料里，你都可以通過幾個沖洗程序來除掉它，但是工作量比較大。鑒于壓力只是增長了一點點，也可以接著用直到壓力到了系統(tǒng)的壓力上限再解決。也可以試著找到壓力增長的因素，盡量避免再次發(fā)生。通常在進(jìn)樣器和分析柱之間接個保護(hù)柱也可以解決這個問題，至少可以延緩壓力的增長。問：OK，我會更換濾片的。假如不行我想清洗柱子，應(yīng)當(dāng)怎么清洗呢？答：一方面要用5-10倍柱體積的水把柱子中的緩沖液置換掉，你這根柱子大約要10-20mL水。然后換到100%甲醇清洗大約15min。以上程序都可以用高流速，由于你的柱子沒有完全堵塞。我會用1.5mL/min。讓我們檢查一下在甲醇中的壓力，甲醇的粘度是0.6cP，所以1.5mL/min的甲醇壓力應(yīng)當(dāng)是800psi左右。假如壓力還是很高，用四氫呋喃（粘度0.5cP）或二氯甲烷（粘度0.4cP）沖洗，或者一起沖洗。每一種溶劑大約20mL左右，假如這個體積內(nèi)不能除掉，那么這個溶劑都不太容易除掉。最后回到開始的流動相。你要保證接下來的流動相與前一中溶劑是互溶的，所以你需要從二氯甲烷到甲醇到水（或50/50甲醇/水）再到甲醇/緩沖液，然后再平衡柱子。你的實驗中流動相比較簡樸，不久就可以達(dá)成再平衡。假如用到離子對試劑就要花費長一點時間來平衡柱子了。13峰面積變化問：同一個樣品反復(fù)進(jìn)樣時，為什么峰面積會變化呢？答：很不幸，因素很多，太多要考慮的。幾乎液相的所有部位都能引起峰面積變化，讓我們依次來看。一方面是進(jìn)樣器，進(jìn)樣器出不同的故障，你就會碰到不同的問題。但是所有的故障中，有氣泡是最重要的一種。假如是手動進(jìn)樣，保證注射器里面沒有氣泡。有定量環(huán)的保證氣泡沒有虹吸到進(jìn)樣環(huán)。自動進(jìn)樣器中假如進(jìn)樣體積比較大，而瓶蓋墊子能很好的包裹住針的話，就會產(chǎn)生一段真空，氣泡就會生成了。氣泡的產(chǎn)生會導(dǎo)致進(jìn)樣之間體積的不規(guī)律變化。假如樣品之間的濃度相差很大，而進(jìn)樣2-3針后同一個峰的峰面積保持不變，那么也許是樣品殘留。手動的話每次進(jìn)樣后都要把注射器好好清洗一下，自動進(jìn)樣器先看看洗針液，保證它能很好的清洗分析物。峰面積的減少也有也許是溫度引起的，但是這個影響很小，小于2%。假如你把樣品從冰箱里拿出來放到進(jìn)樣器里，它會慢慢的升溫，體積就會變大。這樣前后的進(jìn)樣體積就有差別了。流速的隨機(jī)變化也會導(dǎo)致峰面積變化。這通常是由閥門的故障檢查或泵頭的空氣，空穴導(dǎo)致的。通常還隨著著保存時間的改變。你可以通過觀測壓力來確認(rèn)是不是這個問題。多大的改變可以接受取決于峰寬。假設(shè)兩個泵的流速差別有10%，峰寬有20個泵沖程，那么因泵的脈動而產(chǎn)生的峰面積變化只有1%，但是假如峰寬只有1個泵沖程，那么峰面積變化就有10%了。流速改變的另一個潛在因素是系統(tǒng)高壓部位漏液了，這個應(yīng)當(dāng)很容易發(fā)現(xiàn)。積分錯誤更加難以解決。軟件對峰積分的一些大的變化稍微檢查一下就可以看到，但是更多的細(xì)微的變化則很難發(fā)現(xiàn)。信噪比100以下的拖尾峰經(jīng)常會有明顯的積分錯誤。通常，基線噪音限制著積分的精確性但是當(dāng)碰到前沿峰或拖尾峰時，問題變得更糟。你可以試著更改積分參數(shù)，重新解決數(shù)據(jù)，看看能否弱化這個問題。復(fù)雜樣品中假如有肩峰（與目的峰局部分離），軟件就很難判斷基線在哪里。這時采用手動積分或者用強(qiáng)制基線自動積分將會改善積分的重現(xiàn)性。樣品自身也會導(dǎo)致峰面積變化。在反相色譜中發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)在開始的梯度中不能完全洗脫，殘留的會出現(xiàn)在接下來的空白梯度中。這些鬼峰只在特定的蛋白質(zhì)和洗脫程序中出現(xiàn)。假如是這樣，就要在分析樣品后添加空白。此外，蛋白質(zhì)會不可逆的黏附在有些柱子內(nèi)，隨著進(jìn)樣的增長，樣品的峰面積會慢慢變大。據(jù)推測，有些蛋白質(zhì)是結(jié)合在填料的活性部位，一旦這些部位飽和了，峰面積就能反復(fù)了。你不一定用你分析的蛋白質(zhì)來飽和這些部位，有報道此外一些蛋白質(zhì)也有飽和的作用。檢測器會間接的影響峰面積，峰積分的好壞取決于信噪比，當(dāng)峰的信噪比最大時峰面積的反復(fù)性最佳。流動相很少影響峰面積，當(dāng)流動相的組分改變時它更多的是影響保存時間而不是峰面積。鬼峰或者倒峰倒有也許是因流動相影響積分而導(dǎo)致的，這和其他的干擾同樣。用流動相溶解樣品就能避免。問：我該盼望一個如何的峰面積反復(fù)性呢？答：除非受限于信噪比，否則反復(fù)進(jìn)樣峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一定會低于1%，0.2-0.5%都可以達(dá)成。當(dāng)用到內(nèi)標(biāo)時，計算分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比，反復(fù)性會更好，但是即使你用這個方法也不能把RSD降到比0.1%還低很多。14鬼峰問：我進(jìn)空白的時候出現(xiàn)了一個峰，它從哪里來的？答：鬼峰也許在幾個不同的情況下出現(xiàn)，下面我們來討論導(dǎo)致鬼峰的不同因素。一方面，等度和梯度的現(xiàn)象不同樣，所以下面的討論要分兩個部分。1等度色譜所限讓我們定義一下你所說的空白。假如你進(jìn)的是流動相，那么就不應(yīng)當(dāng)有峰，但是假如是其他的，例如你通常溶解樣品的溶液，那么有峰出現(xiàn)是正常的。除流動相外的任何溶液都會干擾流動相和固定相之間的平衡，從而導(dǎo)致峰出現(xiàn)?；厥樟鲃酉嗉偃缌鲃酉嘀械慕M分有輕微保存，就會表現(xiàn)為保存峰，這些峰也許是正峰或倒峰。假如你回收了流動相并且使用了一段時間，你就會發(fā)現(xiàn)在你平常進(jìn)樣時樣品峰的位置會有一個倒峰。前面進(jìn)的樣品聚集在回收溶劑里，固定相表面也部分覆蓋著分析物。當(dāng)你進(jìn)新鮮配置的流動相或者其他的溶劑時，樣品組分就會濃度局限性（相對于含樣品的溶液來說），這個濃度局限性沿柱子流動，速度與其相應(yīng)的峰同樣，這樣與通常色譜相反的圖譜就出現(xiàn)了。這個現(xiàn)象叫做空穴色譜，這些峰叫做空穴峰。這是不回收流動相的其中一個因素。過載和沉淀假如進(jìn)的樣是和流動相同樣，就要跳出柱子和流動相之外看看。例如也許是上一次過載引起的?？纯醋詣舆M(jìn)樣器的洗針能否工作，手動的話確認(rèn)注射器是否徹底清洗干凈，針筒外面也要洗。會不會是前面的樣品組分沉淀或吸附在進(jìn)樣器上？假如是這樣，那么每次進(jìn)樣后這個峰就會減小。保證樣品所有組分都能溶于流動相，最佳的解決辦法是用流動相溶解樣品。流路產(chǎn)生每一次進(jìn)樣都隨著著一次壓力脈動。假如在流路中有死角，例如壓力儀的T型接頭等，壓力脈動會把死角的溶液帶到流路中來，呈現(xiàn)為一個峰。通常這種峰比色譜圖中的峰要寬。檢查一下流路，盡量不留死角。2梯度色譜上面的因素合用與等度色譜，假如你是運營梯度，會有一些其他因素導(dǎo)致空白溶液中出峰。溶液雜質(zhì)流動相中的微小成分和雜質(zhì)會在柱子的初始比例平衡過程中富集在柱子上，當(dāng)梯度中流動相洗脫能力變大時，這些東西會象樣品同樣從柱子上脫離。假如你的流動相有很多雜質(zhì)，出來的圖譜就會有很多的峰。問題的重要來源是水。水有很多途徑帶來雜質(zhì)，涉及凈化系統(tǒng)自身，存儲容器和細(xì)菌生長等等。水凈化系統(tǒng)要經(jīng)常用反相梯度的空白基線來監(jiān)視。此外，推薦購買HPLC級的水。即使使用高質(zhì)量的溶液和溶劑，還是也許會檢測到由溶劑自身導(dǎo)致的峰。這取決于你用的檢測器，假如你用的是紫外檢測器，就取決于檢測波長以及檢測器對流動相折射率改變的敏感性。使用高質(zhì)量的溶劑，梯度背景更象一個圓包而不是一堆峰。含蛋白質(zhì)的樣品假如用反相色譜分析含蛋白質(zhì)的樣品，也有也許在空白中發(fā)現(xiàn)峰，它是由之前的進(jìn)樣帶來的。峰面積會在接下來的空白梯度中迅速減小。除非沒有進(jìn)樣，否則這種現(xiàn)象表白樣品在進(jìn)樣器中過載了。進(jìn)樣器甚至也許會被弄掉線。這是由于有些蛋白質(zhì)在開始的梯度中不完全溶解導(dǎo)致的。例如在特定條件下只有2/3的卵蛋白素溶解在開始的梯度中，在接下來的每一次梯度中都有大約相同數(shù)量的卵蛋白素溶解到流動相中，通過幾次運營之后卵蛋白素的含量就變的微乎其微了，這種現(xiàn)象就是很典型的由蛋白質(zhì)導(dǎo)致的。在我的印象中，還沒有發(fā)現(xiàn)過小分子化合物有這種現(xiàn)象?？偨Y(jié)知道上面這些鬼峰的因素之后就可以采用適當(dāng)?shù)姆乐勾胧﹣肀苊膺@些問題。15pH對保存時間的影響問：我在做一個樣品分離的時候發(fā)現(xiàn)對pH的變化非常敏感。這是一個簡樸的反相方法，沒有用離子對試劑，但是日間的保存時間經(jīng)常改變，我發(fā)現(xiàn)是由pH的細(xì)小變化導(dǎo)致的，怎么會這樣呢？答：從你的描述可以推斷這是一個離子型分析物，它的pKa與流動相的pH很接近，所以你面對的是分析物的兩種形式，它們的保存時間明顯不同，也許是比如酸的質(zhì)子式和非質(zhì)子式。帶電型的保存比非帶電型的保存低很多。兩者處在平衡狀態(tài)，這個平衡由pH決定。pH的微小變化導(dǎo)致分析物兩種構(gòu)型的比例變化，從而導(dǎo)致保存時間變化。因此很有必要嚴(yán)格控制pH。既然你已經(jīng)做了一些實驗，應(yīng)當(dāng)?shù)玫搅俗銐虻臄?shù)據(jù)，知道了pH與保存時間之間的量化關(guān)系。假如沒有，做一些對比實驗來得到這個結(jié)果。此外你也可以查查方法的開發(fā)記錄，這個信息在方法耐用性測試時應(yīng)當(dāng)會出現(xiàn)。一旦得到了這個量化關(guān)系，你要擬定什么限度的保存時間的變化是你能接受的，然后由此計算pH的調(diào)節(jié)精度。即使在很嚴(yán)格的情況下，+/-0.02個pH單位的精度應(yīng)當(dāng)足夠了。問：很難把pH調(diào)的那么精確，我只加一點點酸，pH就變化很大答：很不走運，這表達(dá)你沒有用緩沖液。緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機(jī)溶劑。當(dāng)加入有機(jī)溶劑時，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，涉及你的分析物的pKa都會有同樣的變化。對于液相常用濃度來說，緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右，當(dāng)濃度特別稀的時候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大約+/-1個pH單位。很不幸，我經(jīng)常碰到一些方法完全忽視了緩沖能力。一個例子是pH4.5的KH2PO4溶液，這不是緩沖液，這是鹽溶液。看看這個表，磷酸鹽的pKa是2和7左右，4.5正好在中間，磷酸鹽在這個pH怎么也不也許有緩沖能力的，你需要用另一種緩沖液，例如醋酸。同樣，pH7的醋酸銨也是一個鹽溶液而非緩沖液。由于醋酸銨易揮發(fā)，能用于質(zhì)譜檢測器，醋酸銨的使用多起來了。但是在pH7的時候它不是緩沖液，所以你還不如不用它，除非你有其他理由需要鹽。表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）緩沖鹽pKa醋酸鹽4.75銨鹽9.24硼酸鹽19.24硼酸鹽212.74硼酸鹽313.80檸檬酸鹽13.13檸檬酸鹽24.76檸檬酸鹽36.402-(N-嗎啉代)乙磺酸（MES）6.15草酸鹽11.27草酸鹽24.27磷酸鹽12.15磷酸鹽27.20磷酸鹽312.38三氯乙酸0.52三乙醇胺7.76三乙胺10.72三氟乙酸0.50三羥甲基氨基甲烷（Tris）8.08問：如何才干改善這個方法？答：假如pH擬定了，是用錯了緩沖鹽，那么從表中選一個合適的就可以了。通常替代的鹽不會影響分離，有影響的話就要此外調(diào)節(jié)一下。有時，替代的緩沖鹽不合用于檢測器，就像我們前面提到的質(zhì)譜要用可揮發(fā)的鹽。羧酸鹽因背景吸取高，噪音大而不合用于低紫外檢測。假如你不能找到此外一個適合你的檢測器的緩沖鹽，那你麻煩大了。你要么看著保存時間變化，要么在你用的緩沖鹽的pKa附近重新開發(fā)方法。這個變化很大，所以你還得把這個方法優(yōu)化一下。這聽起來不太好，但是以后就不會有麻煩了。我通常建議在開發(fā)方法的時候一方面要選擇緩沖鹽和pH范圍，然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個策略快速而高效，并且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。你開發(fā)下一個方法的時候應(yīng)當(dāng)考慮一下方法。16柱平衡問：我應(yīng)當(dāng)花多長時間來平衡柱子？答：一旦知道了基本原則，平衡柱子就很簡樸了。平衡柱子所需的時間取決于柱子平衡前的狀態(tài)，流動相組分的濃度以及這些組分的保存系數(shù)。你要知道達(dá)成動態(tài)平衡是不久的，事實上柱子不久就可以達(dá)成本底平衡。因此，平衡重要是受限于流動相組分進(jìn)入或洗出柱子的速度。讓我們先討論柱子在新的流動相組分中的平衡。在平衡過程中，吸附在柱表面的流動相組分大約介于1-20umol/m2。一個典型的填料大約有300m2/g的表面積，典型的液相柱每mL柱體積有0.5g填料，這樣每個柱體積的表面積就有150m2/mL，吸附的流動相組分的濃度是150-3000umol/mL。溶液的表面積濃度通常都比較高，以分子量為32的甲醇為例。固定相濃度以3mmol/mL計，每mL柱體積大約要100mg甲醇才干使表面積完全飽和。假設(shè)柱子內(nèi)部沒有一點甲醇，流動相甲醇比例是10%或更高，1mL流動相就可以將足夠數(shù)量的甲醇帶入柱子，為了充足平衡，可以加大2到3倍等等，然后柱子就平衡了。這表白高濃度的流動相組分可以更快平衡，這也是梯度色譜表現(xiàn)的象梯度的因素之一。相反，假如流動相濃度低，就需要長時間才干平衡。例如，假如柱內(nèi)沒有甲醇，流動相是1%的甲醇，就需要10倍柱體積的流動相才干將足夠數(shù)量的甲醇帶入柱子，這種情況下，不同流動相的平衡就變得很復(fù)雜。假如柱子之前是用乙腈平衡，現(xiàn)在要用1%的甲醇平衡。甲醇要替換掉吸附在填料表面的乙腈，這個平衡就沒那么順利，需要更常的平衡時間。但是我們可以先用高比例的甲醇沖洗柱子再換回1%比例來加速平衡。流動相組分的濃度越低，所需的平衡體積就越大。離子對試劑就是一個例子。它們通常的使用濃度是5mmol/L（5umol/mL），很巧的是它們的表面積吸附濃度也很低，介于1-3umol/m2。同前面同樣計算得到每mL柱體積需要150-450umol的離子對試劑。離子對濃度是5mmol/L時需要30-150個柱體積才干將必需的離子對試劑帶入柱子，充足平衡需要更多的流動相。因此，在我們討論的第一種情況中，限制平衡時間的因素是流動相組分的濃度和它最終在填料表面的濃度。假如我們要加快平衡，增長關(guān)鍵的流動相組分的濃度應(yīng)當(dāng)有用。問：讓我總結(jié)一下你說的。假如要用一個新的流動相組分平衡柱子，要考慮平衡柱子需要多少，有多少溶在流動相里，然后我們可以估算需要多長時間能將必需數(shù)量的組分帶入柱子。但是相反的情況呢，我們要把柱子中的組分除掉時怎么解決？答：總結(jié)的很對的。在第二種情況中，決定平衡的因素是新流動相中吸附在填料表面的化合物的保存系數(shù)。常用的有機(jī)溶劑在通常的流動相中保存系數(shù)都很低，但是在正相色譜中的極性溶劑情況不同樣。例如，當(dāng)用甲醇和正己烷做流動相時，甲醇在硅膠柱上的保存系數(shù)是很大的。要將正相填料表面的甲醇除去，最佳是先用一個中檔洗脫能力的溶劑沖洗，最佳的選擇是正己烷，它通常用來調(diào)節(jié)溶液洗脫能力。假如是正己烷—乙酸乙酯流動相，應(yīng)當(dāng)先用乙酸乙酯沖洗柱子以除去甲醇，然后再用正己烷—乙酸乙酯流動相。假如知道了如何快速平衡柱子，我們就可以設(shè)計一個高效的平衡程序，因此了解柱子的歷史狀況也很重要。另一個強(qiáng)吸附的例子是離子對試劑。建議用過離子對試劑的柱子以后都用于含離子對試劑的實驗，由于填料表面的這些試劑很難除去。兩個因素導(dǎo)致它們強(qiáng)烈的保存在反相填料中：一個是疏水互相作用，另一個是極性互相作用。假如只用對付疏水互相作用，我們可以用強(qiáng)有機(jī)溶劑如THF來沖洗柱子，但是離子對試劑還能與表面硅羥基強(qiáng)烈作用。陽離子對試劑如四丁基銨鹽特別難以去除。所以任何清洗程序都要考慮這些復(fù)雜的互相作用。沒有特別的清洗程序，不也許把離子對試劑完全清除。一個最難的平衡問題是含水正相色譜的平衡。水分通常含量很少，但是它可以強(qiáng)烈的保存在正相填料中，特別是硅膠和氧化鋁。就是由于水分的保存，那些無水烷烴流動相也許要好幾天才干平衡。要除去硅膠中的水分，要用一系列的弱溶劑按程序清洗。一個也許的順序是甲醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，正己烷。這比用正己烷沖洗“濕”柱子更快。問：那么，假如低濃度的流動相不具有強(qiáng)保存成分時，應(yīng)當(dāng)不久就可以平衡了。但是保存時間仍然慢慢的漂移，是什么因素呢？答：這種情況應(yīng)當(dāng)不是平衡自身的因素，也許是其他的問題。是不是流動相比例因揮發(fā)而改變了？是不是實驗室溫度在慢慢變化？有也許是樣品成分累積在柱子里，也有也許是柱子老化，比如固定相水解。后兩種情況通常是歸于柱子改性而不是平衡的范疇。我們將在一個獨立的章節(jié)討論柱子改性問題。17柱改性問：什么是柱子改性？答：上一章我們討論了柱子平衡的問題。平衡導(dǎo)致的現(xiàn)象都是可逆的，但是柱子改性的卻是不可逆的。柱子改性改變了柱子的性能，而這完全是你的責(zé)任。我一般建議不要把柱子改性，但是有時候是無法避免的。問：請給我舉一些柱子改性的例子！答：第一個例子是一個常用的過程，但是我要指出的是我不推薦這樣做的。假如你使用強(qiáng)酸性流動相，pH2或更低，末端封尾的C18柱，那么不久末端封尾基團(tuán)就會水解，因而這個柱子有了比之前大的多的硅羥基活性。這也許會影響分離的選擇性。有人用強(qiáng)酸性流動相開發(fā)方法，等到方法開發(fā)好了，柱子也變了。等用新柱子做同樣的測試時，分離的選擇性就也許不同樣了。但是使用酸性流動相兩三天后，分離也許又變回來了。這根柱子發(fā)生了永久的變化而廠家的說明書上是沒有的。我建議不要用這個程序，但是有的實驗室用新柱子這樣做來獲得柱子改性過程的細(xì)節(jié)。我建議改用非末端封尾的柱子來開發(fā)方法，避免以后柱子改性。另一個改性的例子是發(fā)生在氨丙基鍵合相色譜柱使用水溶液時，它通常在親水互相作用色譜中用來分離糖類。典型的流動相是60-90%的乙腈/水混合液。當(dāng)氨丙基柱第一次用于水溶液時，填料空隙處的高濃度氨基基團(tuán)顯堿性，導(dǎo)致硅膠和鍵合相緩慢的水解。隨著時間的變化，可脫掉的鍵合相越來越少，最后就可以得到穩(wěn)定的保存時間了，但是這根柱子與初始性能相比有了明顯的變化，并且也不能再用于正相分離了，不能象以前同樣使用水性流動相了。只要你使用氨丙基色譜柱分離糖類，改性的問題就無法避免，有的廠家提供專門的柱子來做這個。他們的柱子是已經(jīng)改性好了的，由于廠家的改性的程序和說明都是擬定的，所以最佳還是購買已改性的柱子而不要自己改性柱子。另一個讓人不快樂但是又無法避免的改性現(xiàn)象發(fā)生在分離蛋白質(zhì)的時候，特別是在蛋白質(zhì)體積排阻色譜中使用二醇基柱時。觀測發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)開始進(jìn)樣的峰小于后面的峰，這是由于蛋白質(zhì)非特異吸附到填料上導(dǎo)致的。為了避免這個，有人建議先進(jìn)大量的蛋白質(zhì)，如牛血清蛋白，來改性柱子，使活性位點飽和。通常我不推薦這個改性程序，你應(yīng)當(dāng)