神經(jīng)毒理學基本知識與實驗方法

神經(jīng)毒理學基本知識與實驗方法第一頁，共42頁。神經(jīng)系統(tǒng)生理結構簡介中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)細胞及其附屬器神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞神經(jīng)遞質血-腦和血-神經(jīng)屏障第二頁，共42頁。中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)第三頁，共42頁。細胞及其附屬器神經(jīng)細胞及膠質細胞Astrocytes-star-shapedcellsthathelpsupportthenutritional,immunological,andstructuralrequirementsofneurons.Oligodendrocytes-cellsresponsibleformakingthe"insulation"ofneuronscalledmyelin,asubstancecriticaltotheeffectivetransmissionofnerveimpulses.Ependymacellsthatlinethebrain'ssystemofventricles,spacesthatholdthefluidthatbathesthebrain.Microglia-cellsthatareactivatedbyinjury,infection,ordegenerationtoproduceinflammation,removedeadtissue,andhelpfightinfections.第四頁，共42頁。細胞及其附屬器第五頁，共42頁。神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞第六頁，共42頁。神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞第七頁，共42頁。神經(jīng)遞質遞質的釋放遞質的種類乙酰膽堿去甲腎上腺素γ-氨基丁酸（GABA）氨基乙酸谷氨酸天冬氨酸NO第八頁，共42頁。血-腦和血-神經(jīng)屏障保護神經(jīng)系統(tǒng)免受某些神經(jīng)毒物的毒性作用血-腦屏障（blood-brainbarrier,BBB）血-神經(jīng)屏障（blood-nervebarrier,BNB）

外周神經(jīng)被兩層結締組織鞘膜，即神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜所覆蓋，并于神經(jīng)內(nèi)膜相互交織。BNB由神經(jīng)內(nèi)膜中的血管與神經(jīng)外鞘的扁平細胞提供支持。它的作用不如BBB，因而背根神經(jīng)節(jié)一般較CNS中的神經(jīng)細胞對神經(jīng)毒物更為敏感。第九頁，共42頁。血-腦和血-神經(jīng)屏障第十頁，共42頁。神經(jīng)毒物神經(jīng)毒物神經(jīng)毒物可泛指引起機體神經(jīng)系統(tǒng)功能或結構損傷的外源性的物理、化學或生物因素。外源性的化學物引起的神經(jīng)毒性是損傷機體神經(jīng)系統(tǒng)的主要因素，污染環(huán)境后會持續(xù)存在于我們的生產(chǎn)和生活環(huán)境中現(xiàn)有神經(jīng)毒物分類第十一頁，共42頁?，F(xiàn)有神經(jīng)毒物分類按理化性質、用途金屬類溶劑類氣體類農(nóng)藥類藥物天然毒素按毒作用靶器官神經(jīng)細胞毒物神經(jīng)髓鞘毒物神經(jīng)軸索毒物神經(jīng)遞質毒物請參考：第十二頁，共42頁。金屬類重金屬及其化合物：鉛、汞、砷、鎘。非必需金屬及其化合物：鋁、銻、錫、鉈、鎳、鋰、鋇、鈹、鉍、金。必需金屬及其化合物：鉻、銅、鐵、鎂、錳、鈷、鉀、硒、鋅。第十三頁，共42頁。溶劑類脂肪族烴類：烷烴、烯烴、炔烴、汽油。脂肪族環(huán)烴類：松節(jié)油、環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、正己烷。鹵化物：四氯化碳、氯仿、氯丁二烯、三氯苯、氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、氯丹、氯苯、對-二氯苯、氯甲烷、1，2-二氯乙烷、多氯聯(lián)苯、三碘甲烷。第十四頁，共42頁。溶劑類醇類：乙醇、甲醇、1-丙醇、異丙醇、乙二醇、丙二醇、二乙二醇、丁醇、環(huán)己醇、二丙酮乙醇、2，5-己烷二醇。酚類：甲酚、六氯酚。其他：石油蒸餾物、甲醛、丙酮、甲基丁酮、丙烯酰胺、環(huán)氧化合物、烷基苯乙烯聚合物、乙酯、醋酸丁酯、醋酸戊酯、甲基乙酯、苯胺、松油脂、三甲酚磷酸酯、1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氫吡啶、興奮性氨基酸、磷酸三鄰甲苯酯。第十五頁，共42頁。氣體類一氧化碳、氫化氰、硫化氫、二硫化碳、燃燒產(chǎn)物、汽車尾氣、氨、氮氧化物。第十六頁，共42頁。農(nóng)藥類有機磷類、擬除蟲菊酯、有機氯（開蓬、DDT）。第十七頁，共42頁。藥物及天然毒素鴉片、可卡因、巴比妥、地西洋、阿霉素、長春新堿、鏈霉素、奎寧。蛇毒、蝎毒、蓖麻子蛋白。第十八頁，共42頁。按毒作用靶器官分類神經(jīng)細胞毒物：汞和汞化合物、錳、鋁、谷氨酸、氰化物、鉛、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）。神經(jīng)髓鞘毒物：六氯酚、三甲基錫、鉛、銻。神經(jīng)軸索毒物：正己烷、二硫化碳、taxol、長春新堿、丙烯酰胺、氯丙烯、除蟲菊酯。神經(jīng)遞質毒物：尼古丁、有機磷化合物、氨基甲酸酯類殺蟲劑、可卡因、興奮性氨基酸、苯丙胺。第十九頁，共42頁。神經(jīng)毒作用神經(jīng)毒性(neurotoxicity)是指外源性的物理、化學或生物因素引起的生物體神經(jīng)系統(tǒng)功能或結構損害的能力。神經(jīng)系統(tǒng)損傷結構改變功能改變行為改變第二十頁，共42頁。神經(jīng)毒作用——結構改變結構改變是指神經(jīng)毒物作用后神經(jīng)組織的細胞、軸索、髓鞘及細胞內(nèi)超微結構發(fā)生的病理改變。缺氧性損害：中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧最為敏感，很多毒物可通過引起大腦缺氧而導致大腦器質性損傷。毒物特異性損害：中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性損害、周圍神經(jīng)系統(tǒng)特異性損害、中樞周圍混合型損傷。第二十一頁，共42頁。缺氧性損害吸入高濃度二氧化碳、氮氣、甲烷等——單純性大腦缺氧。神經(jīng)肌肉阻斷劑箭毒堿——呼吸肌麻痹。一氧化碳、亞硝酸鹽、苯的氨基和硝基化合物等親血紅蛋白毒物——血紅蛋白攜氧能力損失。氰化物、疊氮化物、二硝基苯酚、丙二腈——細胞毒性缺氧，即供氧、供血充足但細胞能量代謝過程被阻斷。影響心臟驟停的毒物或急性中毒合并心力衰竭——供血不足引起缺血性缺氧。第二十二頁，共42頁。毒物特異性損害鉛中毒——智力低下、鉛中毒性腦病汞及其有機化合物——情緒不穩(wěn)、易激動、思維混亂、震顫、弱視、聽力喪失、共濟失調、癱瘓MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)——引起不可逆的類似帕金森病的癥狀錳——類似帕金森病和運動障礙孕婦使用可卡因——嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)對外界刺激的反應和認知能力均有下降孕婦大量飲酒——其子代產(chǎn)生顱面畸形和智力低下興奮性氨基酸等神經(jīng)遞質類毒物、鋁、有機溶劑等——中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。周圍神經(jīng)系統(tǒng)特異性損傷毒物有機磷、丙烯酰胺、正己烷、氯丙烯、鉛、砷、二硫化碳等——不同程度的感覺和運動功能障礙。第二十三頁，共42頁。神經(jīng)毒作用功能改變——是在神經(jīng)毒物引起神經(jīng)細胞的結構和生化改變的基礎上而引起感覺、運動功能紊亂。行為改變——是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的綜合功能改變。神經(jīng)毒物可引起腦的各種精神活動能力改變，如抽象思維、記憶與學習、情緒表現(xiàn)、覺醒狀態(tài)、感覺的感受能力、注意力等的改變。由于這些精神活動能力改變，從而出現(xiàn)各種精神障礙或行為缺陷。這些改變涉及大腦網(wǎng)狀結構、基底核、邊緣系統(tǒng)和大腦皮層等結構。由于這些結構受累，導致意識喪失、學習記憶下降、興奮或抑制、情緒性格等改變。這些改變可用行為毒理學方法檢查。第二十四頁，共42頁。神經(jīng)毒性作用特點神經(jīng)毒性表現(xiàn)可隨年齡的增長有所不同。如鉛中毒（血-腦屏障發(fā)育）。神經(jīng)系統(tǒng)損傷常持續(xù)存在。有些神經(jīng)細胞最初是過量存在的，因此對損傷具有一定的緩沖作用，神經(jīng)細胞少量損失不會影響神經(jīng)功能和行為活動。這種細胞過量存在的結果可能會使毒物的作用呈現(xiàn)一個閾值，或呈現(xiàn)非線性的劑量-反應關系。神經(jīng)毒性反應的表現(xiàn)可能是進行性的，輕微的功能損傷也可能變得異常嚴重。某些物質特別是各種藥物在不同劑量下，神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生不同的反應?；瘜W物質的聯(lián)合接觸會產(chǎn)生相互作用。第二十五頁，共42頁。毒物作用一般機制直接損傷作用受體配體的相互作用與立體選擇性作用干擾易興奮細胞膜的功能干擾細胞能量的產(chǎn)生與生物大分子結合

與蛋白質結合與核酸結合與脂質結合膜自由基損傷細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調選擇性細胞死亡體細胞非致死性遺傳改變誘發(fā)凋亡第二十六頁，共42頁。神經(jīng)毒性作用機制神經(jīng)遞質與神經(jīng)毒性通道與神經(jīng)毒性受體信號轉導與神經(jīng)毒性神經(jīng)膠質細胞與神經(jīng)毒性細胞骨架與神經(jīng)毒性第二十七頁，共42頁。神經(jīng)遞質與神經(jīng)毒性神經(jīng)遞質釋放依賴于許多生物化學和電化學活動的協(xié)調作用，不僅與突觸前神經(jīng)元的動作電位有關，還包括鈣動員和突觸前神經(jīng)末梢遞質儲存囊泡與質膜的融合、融合后囊泡中的神經(jīng)遞質被釋放到突觸間隙、與突觸后膜上高度特異性受體結合將化學信息再轉換成電信號或調控其他神經(jīng)化學活動等一系列活動。毒物可通過干擾遞質合成酶活性或遞質前體物質的利用影響神經(jīng)遞質合成；可通過影響囊泡中神經(jīng)遞質的儲存或釋放、影響神經(jīng)遞質滅活或清除（重攝取或遞質分解酶）、干擾神經(jīng)遞質與受體作用或毒物本身直接與受體結合等作用影響神經(jīng)系統(tǒng)正常功能。第二十八頁，共42頁。神經(jīng)遞質與神經(jīng)毒性例：有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑——選擇性抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而抑制乙酰膽堿遞質的滅活，造成突觸間隙大量乙酰膽堿遞質堆積，過度刺激突觸后膜上的相應受體，使突觸后神經(jīng)元正?；顒邮艿接绊?，產(chǎn)生一系列中毒癥狀。最強的脊椎動物神經(jīng)遞質釋放激動劑之一的黑寡婦毒素(latrotoxin)——可引起囊泡內(nèi)的神經(jīng)遞質暴發(fā)性非特異釋放，隨之破壞神經(jīng)末梢?？煽ㄒ蚝退耐愇铩ㄟ^抑制多巴胺和其他單胺的突觸重吸收提高突觸間隙多巴胺遞質濃度。乙醇——影響兒茶酚胺類遞質釋放、吸收和代謝，并刺激GABA受體活性。肉堿毒素——阻斷神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)遞質乙酰膽堿的釋放，引起遲緩性癱瘓。破傷風毒素——阻斷脊髓抑制性神經(jīng)元產(chǎn)生的氨基酸類神經(jīng)遞質釋放，導致肌肉強直，進一步發(fā)展為致死性僵硬和痙攣性抽搐。一些動物毒素如β－金環(huán)蛇毒素——作用于突觸前，通過特異的減少遞質的釋放以阻斷神經(jīng)肌肉傳遞從而致使從而致使運動終板對神經(jīng)刺激不起反應。第二十九頁，共42頁。通道與神經(jīng)毒性Na+通道河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)——能阻斷Na+通道電導的升高，破壞動作電位的生成。擬除蟲菊酯類殺蟲劑和DDT——引起神經(jīng)元電壓門控Na+通道關閉延遲，神經(jīng)元反復持續(xù)去極化造成神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，表現(xiàn)為運動失調、驚厥抽搐、振顫、易激惹和手舞足蹈綜合癥等。局部麻醉藥普魯卡因和可卡因——對Na+通道和K+通道均有阻斷作用。第三十頁，共42頁。通道與神經(jīng)毒性Ca2+通道

Ca2+通道在神經(jīng)和肌肉活動中（包括神經(jīng)遞質和激素釋放、動作電位的生成和興奮性收縮偶聯(lián)等）發(fā)揮著重要作用，因此是許多治療藥物、神經(jīng)毒素和神經(jīng)毒物的潛在作用靶部位。傳統(tǒng)上將電壓依賴性Ca2+通道分為四型，即T-型、L-型、N-型和P-型殺蟲劑胺菊酯——阻斷成神經(jīng)細胞瘤細胞和竇房結細胞的T-型Ca2+通道。辛醇——選擇性阻斷下橄欖體神經(jīng)元T-型Ca2+通道，在成神經(jīng)細胞瘤細胞中阻斷T-型和L-型Ca2+通道。鉛——是一種較強的N-型Ca2+通道非選擇性阻斷物。第三十一頁，共42頁。受體信號轉導與神經(jīng)毒性受體受體可被看作是能與毒物發(fā)生高親和性反應并產(chǎn)生特殊效應的大分子。毒物分子可模擬內(nèi)源性配基，引起激動劑樣作用。毒物分子可能結合于受體，但并不引起激活效應，而是阻斷內(nèi)源性配基的作用（即拮抗作用）毒物可能對受體產(chǎn)生變構效應。如有些毒物不是結合于內(nèi)源性配基的同一位點，而是結合于生物大分子的相鄰部位，這種作用可引起構象變化而影響受體與神經(jīng)遞質的結合。由谷氨酸傳遞的神經(jīng)毒性被稱為興奮毒性（excitoxicity）。信號轉導因子神經(jīng)毒物除了可影響受體以外，還可以影響細胞內(nèi)信號轉導因子如Ca2+、肌醇磷酸酯、蛋白激酶等。即早反應基因c-fos的表達被認為是神經(jīng)毒性的潛在標記。有機氯殺蟲劑林丹柯引起大腦皮層和海馬的c-fos的表達，并具有劑量效應關系。接觸丙烯酰胺的大鼠腦組織也發(fā)現(xiàn)c-fos和c-jun表達增加。

第三十二頁，共42頁。神經(jīng)膠質細胞與神經(jīng)毒性星型膠質細胞在許多神經(jīng)毒性損傷中既有防御作用又有促進作用。如，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸穩(wěn)態(tài)研究中，星型膠質細胞在興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸代謝中具有重要作用：星型膠質細胞具有高親和性谷氨酸遞質攝取系統(tǒng)，它們可通過谷氨酸重攝取或經(jīng)谷氨酰胺合成酶催化作用將谷氨酸代謝為谷氨酰胺，調節(jié)控制細胞外谷氨酸水平。星型膠質細胞還可直接引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。星型膠質細胞中的谷氨酸-谷氨酰胺通路是腦組織中谷氨酸遞質的微型儲備庫。星型膠質細胞腫脹會引起遞質釋放。第三十三頁，共42頁。細胞骨架與神經(jīng)毒性細胞骨架是軸漿運輸本身所固有的結構成分，也是一個易感位點。第三十四頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法神經(jīng)學檢查腦神經(jīng)運動功能檢查反射性檢查步態(tài)異常檢查第三十五頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法形態(tài)學檢查神經(jīng)元胞體神經(jīng)元核周體軸突的近端或遠端髓鞘星型膠質細胞內(nèi)皮細胞第三十六頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法電生理檢查外周神經(jīng)：運動神經(jīng)傳導速度的測定、感覺神經(jīng)傳導速度和動作電位測定、慢纖維傳導速度的測定等肌電圖：將電極探針插入肌肉，在靜息和肌肉收縮時，記錄和檢查肌肉的電活動。神經(jīng)毒性作用可表現(xiàn)為：異常的插入性活動；靜息肌肉的自發(fā)性電活動；隨意性肌肉收縮期間，運動單位出現(xiàn)干擾圖形。第三十七頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法生化檢查糖代謝過程中涉及的酶系統(tǒng)蛋白質合成亞細胞結構髓鞘成分神經(jīng)系統(tǒng)特殊位點的神經(jīng)遞質水平通過使用促效劑和拮抗劑，觀察神經(jīng)遞質受體的結合情況。第三十八頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法行為檢查（大鼠或小鼠精神行為初步測試項目）神經(jīng)行為功能測試行為測試感覺視覺、嗅覺、本位感覺、聽覺定位痛覺甩尾空間定位（方向）翻正反射運動自發(fā)性動作Automex活動肌肉無力前肢抓物、后肢伸肌試驗認知能力學習與保持能力一路式回避法多步式回避情感反應反應性對陣風的驚異性對新奇環(huán)境的應激性生理完善性體溫調節(jié)體重進食與飲水情況主要部位體溫第三十九頁，共42頁。神經(jīng)毒理學研究方法行為檢查（大鼠或小鼠精神行為二級測試項目）神經(jīng)行為功能測試行為測試感覺視覺、嗅覺、聽覺操作心理生理測試痛覺滴定操作測驗空間定位、本位感覺T迷宮辨別味覺味覺辨別運動自發(fā)性動作每日節(jié)律，模仿性肌強度操作反應力振顫