COX2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及機制分析

COX2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及機制分析山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文1414山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文1414山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論艾符號說明（按字母順序）英文縮寫英文全稱中文名稱AAarachidorijcacid花生四烯酸APactionpotential動作電位ASTastrocyte星形膠質(zhì)細胞ACSFanificalcerebrospinalfluid人工腦脊液BrdU5-trtx>mo-2-deoxyuridinje5—漠一脫氧尿昔COX-2cyclooxygenase-2環(huán)氧合醯一2cPLA2cytosolicphosphoJipase&胞質(zhì)內(nèi)磷脂酶A2CTRLcontrol對照組DABdiaminobenzidine二氨基聯(lián)苯DGdentategyms齒狀回ECentorhindcortex內(nèi)嗅皮質(zhì)EGTAethyleneglycoltetraacetate乙二醇四己酸酯ERKextracelLularsignal-regulatedkin<ise胞外信號調(diào)節(jié)激酶F1CTfluoresceinisothiocyanate異硫幫酸熒光黃GCLgranule-celllayer額粒細胞層GFAPglialfibrillaryacidicprotein膠質(zhì)纖維酸性蛋白HEPEShydroxyeihylpiperazineethanesuJfonicacid羥乙基哌嗪乙磧酸lEGsimmediateearlygeges即早基因KAkainicacid海人藻酸LTPLongtermpotentiation長時程增強MAPKMitogen-activatcdproteinkinase絲裂原活化蛋白激酶MFSmossfibersprouting苔蘇纖維發(fā)芽NeuNoeuronalnuclei神經(jīng)元特異性核蛋白NMDAN-methylD-aspartatcN-甲基一D—天門冬氨酸p-ERKphospharjlated-ERK磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶PGsprostaglandin前列腺素PMSFphenyImethylsuJfony1fluoride苯甲基橫酰氟PSpopulationspikes群峰電位SEMatusepilepticus攧癇持續(xù)狀態(tài)sEPSCspontaneousexcited

山東大學博士學位論文postsynapticcurrent自發(fā)性興奮性突觸后電流sIPSCsspontaneousexcitedposi^ynapiiccurrent自發(fā)性抑制性突觸后電流SRSspontaneousrecurrentseizures自發(fā)性反復痛性發(fā)作svzsubventricularzone室管膜下區(qū)TEMEDN^NjSI'Jtf^Tetjam^hylethylenediamme四甲基乙二胺TLEtemplelobeepilepsy顯葉癒癇TRICTtetramethylihodamitieisothiocyanate四甲基異硫甌酸羅丹明TTXletrodotoxm河豚毒山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文優(yōu)秀畢業(yè)論文優(yōu)秀畢業(yè)論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究所取得的成果口除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果.對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。論文作者簽名：傍洛名—日期:if關于學位論文使用授權的聲明本人完全了解山東大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留或向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱I本人授權山東大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文和匯編本學位論文。（保密論文在解密后應遵守此規(guī)定）論文作者簽名： 一導師簽名n曲泛磴日期：Ew版，允許論文被查閱和借閱；本人授權山東山東大學博士學位論文C0X-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及機制研究專業(yè)：兒科學博士生：張海菊導師，孫若鵬教授中文摘要研究背景及目的，大量臨床回顧性研究資料表明，在伴有海馬硬化性顎葉癒痛的成人患者中有相當高比例可追冋到兒童早期有長時間癇性發(fā)作史，尤其是高熱驚厥.幼年早期長時間癇性眾作后大腦可塑性發(fā)生的改變對個體能產(chǎn)生長遠的影響，與海馬硬化性額葉癲癇的形成密切相關.海馬環(huán)路內(nèi)的軸突出芽，突觸重建是顓葉癲癇的主要的病理生理特征《在額葉瘢癇的形成與維持中發(fā)拝重要作用?在攧斕形成過程中'神經(jīng)元之間形成異常的突觸聯(lián)系，建立了病理性｛功能性或形霊性)神經(jīng)環(huán)路.海馬突觸聯(lián)系的可塑性是癲癇發(fā)生后突觸重建的基礎『癲痛發(fā)作可導致神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)增生,突觸后終端與膠質(zhì)細胞之間形成突觸，突觸后終端的樹突棘的形査學的變化引起突觸結構的改變，與膠質(zhì)細胞之間形成的突觸為異位突觸「同時癇性發(fā)作也導致異常神經(jīng)發(fā)生，引起顆粒緬胞層彌散，新生的顆粒神經(jīng)元有較多的基部樹突向齒狀回投射，引起海馬內(nèi)環(huán)路性質(zhì)的變化，成為慢性反復性癇性發(fā)作的基礎,環(huán)氣合酶一2(C0X-2)及其代謝產(chǎn)物在中樞起多種調(diào)節(jié)作用,與長時程突觸可塑性形成和突觸重構密切相關"近年許多研究均發(fā)現(xiàn)長時間痛性活動發(fā)作后，G0X-2在腦內(nèi)迅速被誘導激活，在大腦皮層.海馬、杏仁核等處廣泛表達，詩多研究表明COX-2抑制劑能明顯對抗戊四氯誘導的驚厥發(fā)作，且在電休克誘導的驚厥模型中，華妥因聯(lián)合CQX我抑制劑能增強其抗驚厥作用.目前有關C0X-2在癒癇是否參與了領葉癒癇海馬環(huán)路內(nèi)突觸重建，從而促進了願葉癒癇的形成與發(fā)展尚不清楚，且其抑制劑抗驚殷的作用機制國內(nèi)外均未見有進一步深入的研究.本山東大學博士學位論文法：檢測指標山東大學博士學位論文法：檢測指標機0X.2、C.fos及P.ERKl/2優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文法：檢測指標山東大學博士學位論文法：檢測指標機0X.2、C.fos及P.ERKl/2優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文研究旨在研究COX.山東大學博士學位論文研究旨在研究COX.2在癇性發(fā)作活化后的優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文研究旨在研究C0X-2在羯性發(fā)作活化后的表達特點，看COXJ抑制劑是否能通過抑制C0X-2的活性來卽正癇性活動引起腦內(nèi)微環(huán)境改變所致的海馬異常突觸重構，從而減少慢性期自發(fā)性反復性痛性發(fā)作（SRS）的發(fā)生，研究其在癇性發(fā)作后突觸重構密切相關的異常神經(jīng)發(fā)生及膠質(zhì)細胞活化和增生等事件中的作用及發(fā)揮作用的細胞信號轉導途徑.C0X?2抑制剤對癇性發(fā)作后海馬結構和功能改變這種長時程事件的影響是通過對神經(jīng)元突觸電活動的影響而實現(xiàn)的，可能和影響神經(jīng)避質(zhì)釋放及改變離子通道通透性等有關.而NS離子通道是許多抗癲痛藥物的治療靶點。我們通過建立體外海馬腦組織切片癇樣放電模型，向腦片灌流液中加入C0X-2抑制閭，觀察其對海馬CA】椎體神經(jīng)元膜興奮特性、鈉離子通道及突觸活動的影響.從多角度.多層次來研究C0X-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及其機制，看能否提供新的控制攧癇發(fā)作的治療策略和預防靶點.方法'1,體內(nèi)部分實驗：模型制作=隨機將120只體重為50?SOg的3周齡健康對star幼鼠分為匹魯卡品致癇組（EP—Only組）3=45）和塞萊昔布干預致癇組（EP—Olecoxib）3=45）和生理鹽水正常對照組（NS組）（n=30）3組,匹魯卡品攧痛模型的建立，腹腔注射1。％匹魯卡品350mg/kg,若注射匹魯卡品后30min無驚厥發(fā)作，再按每次lOrng/k価如匹魯卡品，若驚歟發(fā)作持續(xù)30min（定為癲癇持續(xù)狀態(tài)的標準）仍未停止，則給予10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射,及時終止發(fā)作。EP-Celecoxib組大鼠在注射東蔑宕堿前45血預先通過胃管灌入2Qmg^g.d的塞萊昔布，腹腔注射完匹魯卡品后每天均技此剤量灌胃,直至動物被處死’隨機在EP^nly及EP-Celecoxib組各取10只匹魯卡品成功誘導急性發(fā)作幼鼠進行腹腔注射RrdU,劑量lOOmg/kg,從急性發(fā)作當天開始，隔天注射一次，直到發(fā)作后第14天*〈1）動物行為學觀察，根據(jù)R^ine分級評價癇性發(fā)作行為.觀察急性期癒炳幼鼠癇性發(fā)作行為在各組的差異,監(jiān)測慢性期（急性發(fā)作后28-42天）自發(fā)2 性.皮耳性'fSRS',H偵'jM史切愛立各紙?：MR<2）形態(tài)學檢測：各試驗組分別在急性發(fā)作后第14天，28天處死大鼠制備組織切片"①Ni細染色，檢測海馬神經(jīng)元損傷及丟失情況］②免疫組織化學方 山本大學，士學位論文 [V法；檢測指標有COX-2,C&s及p-ERKl/2陽性細胞在各組的表達變化趨勢，0X42標記少突膠質(zhì)細胞的活化?比較小膠質(zhì)細胞的活化在各組的差異：BrdU標記増殖的新生細胞，N應N為特異性神經(jīng)元標志，GFAP為星型膠質(zhì)細胞特異性標志，BrdU+NenN熒光免疫雙標標記痛性發(fā)作后新生神經(jīng)元，BidU+GFAP免疫雙標標記增生的星型膠質(zhì)細胞，觀察神經(jīng)前體細胞的增殖及分化在各組的差異：(3)westernblot方法*檢測C0X—2、C-fb』ERK1,ERK2及磷酸化ERK1/2(p-ERKt/2)蛋白水平在癇性發(fā)作后lh、Id.4d.7d、14d、28d各時點的表達及變化趨勢，比較在匹魯卡品誘導SE后的靜止期其表達水平在各組的表達是否有差異，探討COX-2及其抑制劑發(fā)揮作用的細胞信號轉導途徑. ”大體外試驗部分'離體海馬腦片痛樣放電模型的建立；生后14天齡SD大鼠，快速斷頭取腦后用振動切片機切成400jim海馬組織腦切片，用電刺激誘發(fā)CA1區(qū)錐體神姓元記錄場電位，以群峰電位(PS)個數(shù)和幅度的變化來評價腦片放電的變化，權流不同濃度青霉素，觀察到藥物作用約3min后PS個數(shù)増多和幅度増加.有明顯的癒癇樣放電，建立離體海馬腦片癇樣放電模型，從以下幾方面來觀察COX-2抑制劑NS-398對癇性放電后海馬錐體神經(jīng)元電生理特性的影響：(1)CQX-2抑制劑NS-3判對育霉素致癇腦片CA1場電位的影響；腦片濯流液中灌流不同濃度NS-39S,觀察對PS個數(shù)和幅度的影響；<2)腦片全細胞記錄技術研究NS-398對青霉素致痛幼鼠海馬腦片CA1區(qū)椎體神經(jīng)膜興奮特性的影響，分析對動作電位幅度.頻率.潛伏期和時程的影響；通過給予不同階躍模式的電壓刺激，觀察NS-398對電壓依賴性鈉離子通的影響，分別研究對其激活曲線和失活曲銭的影響扌全細胞記錄G濁一酸模式下，觀察NS-398對海馬CA】錐體神經(jīng)元遞質(zhì)釋放和突觸活動的影響，分別記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流怎EPSCQ和自3發(fā)性抑制性突觸后電流CsIPSCs),觀察NS—398對其幅度和頻率的影響，結果，L體內(nèi)實驗部分,山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文（1）動物行為學觀察：匹魯卡品腹腔注射后,優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文（1）動物行為學觀察：匹魯卡品腹腔注射后,優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文（I）動物行為學觀察：匹魯卡品腹腔注射后，致癇成功率72.2%,動物總死亡率8.9%,模型成功率633%.急性癒癇持續(xù)狀態(tài)（SE）后24-30小時進入靜止期，28-42天出現(xiàn)SR乩生理鹽水對照組未出現(xiàn)急性期癇性發(fā)作及慢性期自發(fā)發(fā)作。①急性期；EP-only組全身性驚厥發(fā)作率（89.9%）明顯高于EP-Celecoxib組（55.6%）（P<0.01）；EP^only組癇性發(fā)作Racine分級強度（35±t3）明顯高于EPtetecoxib組發(fā)作強度（2.5土LD（P<0.05）；②慢性期監(jiān)測*在EP-Only組SRS發(fā)生率（50%）明顯高于EP-Ceelecoxib組（30略）<p<0.05sj^test）,EP-On版組平均每天SRS發(fā)生的頻率（1.9±0.58）明顯高于EP-Celecoxib蛆（0.6土。,3）（p<0.0Lttest）tC2）形態(tài)學檢測結果匚?Nissl染色結果；匹魯卡品誘導癇性發(fā)作14天后.海馬CAI.CA3及門區(qū)均有明顯受損的異常神姓元及神經(jīng)元的去失，但EP-Only組各區(qū)神經(jīng)元丟失均?EP-Celecoxib組多<CA1區(qū)48%vs25%t。用區(qū)缽3%vs24%;門區(qū)46%vs22%）：②免疫組化結果：I，COX-2免疫反應陽性細胞的表達：匹魯卡品致癇14天后，海馬區(qū)CQX-2陽性細胞表達在EPQnly組明顯高于EP-Celecoxib組。5&土18VSHS+20）（p<o.mII.小膠質(zhì)細胞活化標志物OX-I2免疫陽性細胞的表達zOX-42陽性細胞的數(shù)量在致癇后14天EP-Only組明顯高于EP-Celecoxib組<p-0.005）,；IILBMU+NeuN和BMu+GFAP免痕雙標結果十急性期發(fā)作28天后，BrdU+NeiiN免疫雙標陽性細胞在EP-Only組明顯高于EP-Celecoxib組（36±4Vs22土3由同時EP-Only組門區(qū)有Brdu+GFAP免疫雙標陽性的新生的膠質(zhì)細胞明顯比EP-Cdccoxib組高（26±3Vs14±2LCOX-2抑制劑能抑制膠質(zhì)細胞的生成：（3）westemblot結果：?COX-2>白的表達工正常對照組海馬表達極低量COX-2蛋白，SE后1小時表達急劇增高達高峰，后表達水平逐漸下降，但在28天仍高于正常對照組。而在塞萊昔布處理組中，C0X-2的表達明顯?EPOdy組降低.在急 山東大學博士學位論文性發(fā)作后4天，COX-2在EP-Only組的表達是EP-Cdecoxib組的13倍，14天時前者是后者的1-5倍；②C-fbs蛋白濃度在致癇后靜止期各時點，EPpily組表達均較EP-Celecoxib組高，且均在致痛后Id達高峰后逐漸下降，致28天時濃度水平與對照組無明顯差異（P>0.05>；③MAPK/ERK信號系統(tǒng)的活動和表達：匹魯卡品致痛后lh磷酸化ERK1/2水平迅速升高，Id達高峰為正常組的近1。倍，塞萊昔布干預組各時點磷酸化ERK1/2表達顯著低于EP-Only組（pVO.Ol）但仍高于對照組（p<0,01）.非磷酸化的ERK】和ERK2在海馬的表達強度高于磷酸化ERK1/2,但在幼鼠癇性發(fā)作后無明顯增強（p>0,05）.X體外實驗部分】（1） C0X-2抑制劑NS-398對青霉素誘導的海馬痛樣放電的影響tNS-398濃度為10UM時,對青霉素透發(fā)的癒癇樺放電沒有多大的抑制效應有明顯的抑制作用,3。卩64抑制作用很強，明顯降低PS的幅度和減少其頻率：（2） NS-398對電壓依賴性鈉電流的影廂，NS-39S能降低電壓依賴性鈉通道的電流幅度以及延長鈉通道的不應期，加入N&3閥不能明顯改變鈉通道的電壓依賴性激活狀態(tài)（PX.Q5）.但加入2。卩MNS-39&電壓依賴性鈉失活電流的失活曲線明顯向負極化方向移動.NS-398能明顯延長電壓依賴性鈉電流的失活時間,COX-2抑制海馬神經(jīng)元放電是通過延長鈉通道的失活時相而實現(xiàn)的導致鈉通道開放頻率下降，神經(jīng)元發(fā)放動作電位頻率也相應下降】（3） NS—398對動作電位的影響：COX-2抑制劑能抑制動作電位的幅度和傳播頻率，延長動作電位的潛伏期和時程來延近錐體神經(jīng)元動作電位的傳導，最終導致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的發(fā)放的減少了<4）對神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸后龜流（sEPSCs）和自發(fā)性抑制性突觸后電流<sIPSCs）的影響:NS-39S能明顯抑制致癇大鼠海馬錐體神經(jīng)元sEPSCs的頻率，但是對其幅度及衰減沒有明顯的影響;同時NS-398能明顯增強致痼大鼠海馬腦片錐體神經(jīng)元sIPSCs的頻率，明顯延長sEPSCs的衰減時間，對電流幅度影響不大.山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文山東大學博士學位論文優(yōu)秀畢業(yè)論文#山東大學博士學位論文inhumantemporallobeepilepsy:increasedexpressionofhighlypolysialylatedneuralcelladhesionmoleculeinthehippocampusandtheentorhina!cortex,AnnNeurol.1998；44:923-34,LukiwWJ,CuiJQMust。AE,etal.Epilepiogenesisindiacylglycerolkin畋epsilondeficiencyup-regulatesCOX-2andtyrosinehydroxylaseinhippocampus.BiochemBiophysResCommun.2005;338:77-8】.&SeibertK,ZhangY、LeahyK,etal.Pharmacologicalandbiochemicaldemonstrationoftheroleofcyclooxygenase2ininflanunauonandpain.ProcNatlAcadSciUSA.1994；91:12013-7.SubbaramaiahK,ZakimD,WekslerBBetal.Inhibitionofcyclooxygenase:a.novelapproachtocancerprevention.ProcSocExpBiolMed.1997;216:201-10.KawaguchiK,HickeyRW,RoseME,etahCyclwxyg^nasc-2expressionisinducedinratbrainafterkainate-inducedseizuresandpromotesneuronaldeathinCAShippocampus.BrainRes.2005;1050:130-7..ILWillingaleHL,GardinerNJ,McLymontN,etal.Prostanoidssynthesizedbycyclo-oxygenasehofbrmsinratspinalcordandtheircontributiontothedevelopmentofneuronalhyperexcitability.BrJPharmacoL1997Dec;122(8):1593-604.12*ChenC,MageeJCtBazanNGCyclooxygenase-2regulatesprostaglandinE2signalinginhippocampallong-termsynapticplasticity.JNeurophysioL2(X)2;87:2851-7.13.DhirA,NaiduPS,KulkamiSK.Effectofrofecoxib,acyclo-oxygenase-2inhibitor,onvariousbiochemicalparametersofbrainassociatedwithpentylenetetrazol-inducedchemicalkindlinginmice.FundamClinPharmacoL2006;20:255-6L14+ShafiqN,MalhotraS,PandhiRAnticonvuJsantactionofcelecoxib(aloneandincombinationwithsub-thresholddoseofphenytoin)inelectroshockinducedconvulsioihMethodsFindExpClinPharmacoL2003;25:87-90+McIntyreDC,PoulterMO,GilbyBLKindling:someoldandsomenew.EpilepsyRes,2002;50:79-92.KangTC,KimDS,KwakSE,etal.Epileptogenicrolesofastroglialdeathandregenerationin(hedentategyrusofexperimentaltemporallobeepilepsy.Glia.2006;54:258-71.DhirA,NaiduPS,KulkamiSICEffectofcyclooxygenase-2(COX-2)inhibitorsin山東大學博士學位論文山東大學博士學位論義variousanima]models(bicuculline,picrotoxin,maximaleiectroshock-inducedconvulsions)ofepilepsywithpossiblemechanismofaction.IndianJExpBioL2006;44:286-91.18-TuB,BazanNGHippocampalkindlingepileptogenesisupregulatesneuronalcyclooxygenase-2expressioninneocortex.ExpNeurol,2003;179:167-75+K>TkanidesS,MooreAH,OlschowkaJA^etaLCycIgxygenase-2modulatesbraininflammation-relatedgeneexpressionincentralnervoussystemradiationinjury.BrainResMolBrainRes,2002;104:159-69.TakemiyaT,SuzukiK,SugiuraH,etal.InduciblebrainCOX-2facilitateslherecurrenceofhippocampalseizuresmmouserapidkindling.ProstaglandinsOtherLipidMediaL2003;71:205-16.OkadaK,YuhiT,TsujiS,