流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展

流感疫苗生產(chǎn)及研究進(jìn)展目前一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)

內(nèi)容病毒性滅活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生產(chǎn)工藝33流感疫苗研發(fā)44目前二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)病毒性滅活疫苗概述定義及分類病毒接種和培養(yǎng)采用物理或化學(xué)的方式將病毒滅活其他的生產(chǎn)步驟成品培養(yǎng)基質(zhì)流感疫苗：雞胚出血熱及森腦疫苗：原代地鼠腎細(xì)胞狂犬疫苗：Vero細(xì)胞滅活方法：加熱滅活劑（福爾馬林等）純化：純化全病毒疫苗裂解：裂解疫苗亞單位：亞單位疫苗純化全病毒疫苗：凍干人用狂犬病疫苗出血熱、森腦----含氫氧化鋁佐劑裂解：流感病毒裂解疫苗滅活疫苗：稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。目前三頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)長春公司的病毒性滅活疫苗

工藝流程名稱病毒培養(yǎng)病毒純化病毒裂解病毒滅活半成品配制及分包裝凍干人用狂犬病疫苗基質(zhì)：Vero細(xì)胞培養(yǎng)方式：生物反應(yīng)器超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：β-丙內(nèi)酯凍干雙價腎綜合征出血熱疫苗森林腦炎滅活疫苗基質(zhì)：原代地鼠腎細(xì)胞方式：轉(zhuǎn)瓶超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：甲醛含鋁佐劑流感病毒裂解疫苗基質(zhì)：雞胚方式：孵化間超濾濃縮；蔗糖密度區(qū)帶離心裂解劑：TritonX-100滅活劑：甲醛無硫柳汞目前四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)兩種滅活劑的比較簡要介紹滅活機(jī)理優(yōu)缺點(diǎn)甲醛甲醛，化學(xué)式HCHO，稱蟻醛。無色氣體，有特殊的刺激氣味，對人眼、鼻等有刺激作用。既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基（如A,G,U），又可作用病毒殼蛋白。1）病原體蛋白的抗原性嚴(yán)重破壞，可能有病原體存活；2）滅活時間長；3）易受溫度、pH、濃度、是否存在有機(jī)物、病原體的種類和含氮量等因素影響；4）殘留的游離甲醛，注入機(jī)體后，會產(chǎn)生制激性反應(yīng)。β-丙內(nèi)酯一種雜環(huán)類化合物(C3H4O2)，沸點(diǎn)155℃，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用。作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的，而不直接作用于蛋白。

1）不破壞病毒的血凝素抗原,保持病毒良好的免疫原性；2）滅活時間短；3）其水解產(chǎn)物對機(jī)體無害，接種反應(yīng)輕。目前五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)常用的裂解劑簡要介紹機(jī)理TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對細(xì)胞膜的通透性。TritonN-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）溶解脂質(zhì)

CTAB十六烷基三甲基溴化銨,陽離子表面活性劑，是一種陽離子去污劑與非離子及兩性離子表面活性劑有良好的配位性，對多種油脂具較好的乳化作用,有輕微脫脂作用.目前六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病。常造成不同程度的流行，對人類的健康造成巨大的威脅。慢性病惡化、繼發(fā)感染、其它……-痛苦不堪-缺課或缺勤-就醫(yī)-使用抗生素-住院-死亡流感流感和流感病毒目前七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感的流行特點(diǎn)是在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴發(fā)流行及散發(fā)。具有一定的季節(jié)性：溫、寒帶地區(qū)常在冬、春季節(jié)流行，但熱帶和亞熱帶地區(qū)任何季節(jié)都可以流行。流感病毒傳播迅速、流行廣泛、抗原易變異，人群的特異性免疫狀況不穩(wěn)定。發(fā)病率高，并伴有一定的死亡率。最高的為青少年，高危人群為年邁體弱或帶有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中總要造成不同程度的超額死亡。流感患者和隱性感染者是流感的主要傳染源。從潛伏期末到發(fā)病的急性期（約7天）都有傳染性。死亡率升高超過一定的正常臨界水平目前八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)目前九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感病毒的超細(xì)微結(jié)構(gòu)照片流感病毒電鏡照片流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)目前十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前十三頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)

甲型流感病毒基因組各節(jié)段的大小與功能節(jié)段長度（bp）編碼蛋白主要功能RNAI2341PB2RNA轉(zhuǎn)錄酶；識別和結(jié)合來源于宿主細(xì)胞的帽子RNA22320PB1RNA轉(zhuǎn)錄酶主要成分；啟動轉(zhuǎn)錄和RNA合成延伸RNA32233PA具有解旋酶話性RNA41778HA結(jié)合靶細(xì)胞受體，誘導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞融合誘導(dǎo)中和抗體，凝集紅細(xì)胞RNA51565NP與基因組RNA結(jié)合，參與形成核糖核蛋白（RNP）顆粒RNA61413NANA活性；水解細(xì)胞多糖受體，協(xié)助新生病毒顆粒從被感染宿主細(xì)胞表面游離下來，促使子代病毒釋放RNA71027M1、M2病毒基質(zhì)膜蛋白，有保護(hù)作用；質(zhì)子通道作用RNA8890NS1、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白，抑制宿主細(xì)胞蛋白合成或參與

vRNA合成目前十六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感病毒的理化特性

流感病毒對熱敏感，通常56℃30min被滅活，但有些毒株56℃90min被滅活。

最適PH為可被紫外線滅活因其為帶囊膜的病毒，故對乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑敏感。目前十七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感病毒的變異原因：流感病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)天然宿主的廣泛存在密切接觸方式：抗原漂移（Antigenicdrift）

--小變異，同一亞型

--基因點(diǎn)突變所致

--引起流行抗原轉(zhuǎn)換（Antigenicshift）

--大變異

--基因片段交換

--引起大流行目前十八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)抗原漂移（AntigenicDrift）RNASialicacidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA和/或NA基因的點(diǎn)的變異頻繁發(fā)生A型和B型發(fā)生目前十九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)抗原轉(zhuǎn)換（Antigenicshift)人類和動物毒株的RNA發(fā)生交換(HA和/或NA基因的全球性變異),導(dǎo)致新的亞型出現(xiàn)少見但后果嚴(yán)重只在A型出現(xiàn)目前二十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)191819401960198020002020H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918SpanishInfluenzaH1N11957AsianInfluenzaH2N21968HongKongInfluenzaH3N22009NovelInfluenzaH1N1H71980198519952005197519962002H520021997H91999流感的流行情況目前二十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)抗原漂移所引起的歷史上的流感流行PB1HANAPB1NA目前二十二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)NEnglJMed10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒4種不同來源的基因4differentgenes:北美豬流感病毒NorthAmericaswine歐亞豬流感病毒Asia/Europeswine人流感病毒Humaninfluenza禽流感病毒(非H5)Avian(Non-H5)目前二十三頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感的實(shí)驗(yàn)室診斷目前二十四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)流感已成為全球患病人數(shù)最多的一類疾病。接種流感疫苗是目前預(yù)防和控制流感最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段，已被廣泛采用，并證明有效率達(dá)到70％以上。

流感疫苗目前二十五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前，使用的流感疫苗是三價的，包括兩種甲型（H1N1，H3N2）和一種乙型(B)流感病毒抗原成分，應(yīng)用最廣泛的有：

滅活：Inactivatedinfluenzavaccine（IIV）：6月以上減毒：Liveattenuatedinfluenzavaccines（IAIV）：2-49歲

當(dāng)前主要應(yīng)用的疫苗種類目前二十六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)

滅活疫苗種類和生產(chǎn)工藝全病毒疫苗裂解疫苗亞單位疫苗第一代全病毒價格較低，但副反應(yīng)較高，部分人群不適宜接種，已逐漸淘汰第二代裂解接種效果好，臨床副反應(yīng)較少，適合各年齡段人群接種第三代亞單位有效抗原含量高，更安全，價格較高滅活疫苗種類目前二十七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)3-4月份10-11月份WHO發(fā)布毒株生產(chǎn)企業(yè)獲得和培育毒株疫苗生產(chǎn)銷售每年世界衛(wèi)生組織根據(jù)上一年流感病毒流行情況預(yù)測下一年度流感病毒流行株并向各生產(chǎn)企業(yè)發(fā)布從WHO合作實(shí)驗(yàn)室獲得病毒疫苗株，并將病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)，制備毒種將病毒接種到雞胚內(nèi)培養(yǎng)，收獲尿囊液，經(jīng)純化、滅活、裂解后制備成疫苗2月份9月份5-9月份12-次年4月9月-次年2月份5月-9月生產(chǎn)周期5-6個月生產(chǎn)工藝目前二十八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)生產(chǎn)工藝目前二十九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)單價原液制備目前三十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)毒種和病毒尿囊液制備毒種MOI接種量溫濕度培養(yǎng)時間通風(fēng)溫度時間顏色量目前三十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)選胚目前三十二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前三十三頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前三十五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)接種目前三十七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)培養(yǎng)目前三十九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)收獲目前四十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)純化目前四十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)裂解目前四十三頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前四十八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)產(chǎn)品名稱檢定項(xiàng)目藥典標(biāo)準(zhǔn)主代種子無菌檢查無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢查符合規(guī)定鑒別試驗(yàn)采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml外源性禽白血病病毒檢測陰性外源性禽腺病毒檢測陰性工作種子無菌檢查無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢查符合規(guī)定鑒別試驗(yàn)采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml質(zhì)量控制目前四十九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)中間產(chǎn)品質(zhì)量控制中間品檢定項(xiàng)目長春公司企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)病毒收獲液微生物限度<105CFU/ml沙門氏菌陰性血凝滴度≥1:160細(xì)菌內(nèi)毒素<10EU/ml蛋白含量≤3.5mg/ml病毒濃縮液蛋白含量≤10mg/ml細(xì)菌內(nèi)毒素<160EU/ml病毒純化液蛋白含量≥2.0mg/ml病毒裂解

純化液蛋白含量≥0.5mg/ml病毒滅活

純化液細(xì)菌內(nèi)毒素＜0.2EU/ugHA滅活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)符合規(guī)定微生物限度<10CFU/ml目前五十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)單價病毒原液質(zhì)量控制單價病毒原液檢定項(xiàng)目長春公司企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)鑒別實(shí)驗(yàn)抗原性與推薦的病毒株相一致血凝素含量≥90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量的4.0倍無菌檢查符合規(guī)定病毒裂解

效果檢查病毒顆粒應(yīng)裂解完全。每次更換流感病毒毒株后生產(chǎn)的前三批單價病毒液須進(jìn)行該項(xiàng)檢查。目前五十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)某些病毒能夠與人或動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這稱之為紅細(xì)胞凝集反應(yīng)（HA）。這種凝集反應(yīng)被加入的特異性血清所抑制，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）。血凝和血凝抑制試驗(yàn)?zāi)壳拔迨揬總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)血凝和血凝抑制試驗(yàn)?zāi)壳拔迨揬總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)血凝素含量檢測（單擴(kuò)）目前五十四頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)直線目前五十五頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)半成品質(zhì)量控制半成品檢定項(xiàng)目長春公司企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)無菌檢查符合規(guī)定血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量應(yīng)為配制量的80%～120%裂解劑殘留量≤150ug/ml目前五十六頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)成品檢測指標(biāo)成品檢定項(xiàng)目長春公司規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)鑒別實(shí)驗(yàn)抗原性與推薦的病毒株相一致外觀微乳白色液體，無異味裝量應(yīng)不低于標(biāo)示量pH值6.8～7.8血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量應(yīng)為配制量的80%～120%游離甲醛含量≤50ug/ml卵清蛋白含量≤100ng/ml總蛋白含量≤350ug/ml,不高于血凝素總含量的3.5倍細(xì)菌內(nèi)毒素≤20EU/ml抗生素殘留量≤50ng/劑無菌檢查符合規(guī)定異常毒性檢查符合規(guī)定目前五十七頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)目前廣泛應(yīng)用流感疫苗季節(jié)性四價流感疫苗細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗噴鼻減毒活疫苗基因工程流感疫苗病毒樣顆粒、病毒載體及DNA流感疫苗通用流感疫苗研發(fā)與展望目前五十八頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)疫苗效果影響因素目前五十九頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)接種疫苗是當(dāng)今預(yù)防和控制流感發(fā)生和流行最有效的手段。目前，使用的流感疫苗是三價的，包括兩種甲型（H1N1，H3N2）和一種乙型(B)流感病毒抗原成分，應(yīng)用最廣泛的有：

滅活：Inactivatedinfluenzavaccine（IIV）：6月以上減毒：Liveattenuatedinfluenzavaccines（IAIV）：2-49歲目前廣泛應(yīng)用的流感疫苗目前六十頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)近年獲批上市的新型流感疫苗充實(shí)一下新型流感疫苗表疫苗種類商品名廠家批準(zhǔn)地批準(zhǔn)時間劑量對象備注佐劑疫苗Fluad?Novartis歐洲1997—≥65YMF59/AS03皮內(nèi)注射疫苗Intanza?/IDflu?SanofiPasteur歐洲20099μg/株15μg/株18-59Y≥60Y—高劑量疫苗Fluzone?SanofiPasteur美國200960μg/株≥65Y—細(xì)胞培養(yǎng)疫苗Influvac?TCSolvayPharmaceuticalsInc荷蘭2001——MDCKOptaflu?Novartis歐洲2007—亞單位＞18YMDCKFlucelvax?Novartis美國2012—亞單位＞18YMDCKCeltura?Novartis歐洲—H1N1pdm09亞單位—MF59Celvapan?Baxter歐洲—H1N1pdm09全病毒＞6MVEROPreflucel?Baxter美國—裂解18-49YVERO重組HA疫苗FluBlok?ProteinScience—201345μg/株18-49Y—目前六十一頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)1985年后在全球流行的原單一譜系B型流感病毒B／Yamagata，逐漸演變?yōu)槎N抗原性截然不同的B／Victoria和B／Yamagata二個譜系交替或者一個譜系為主的混合流行。這二個譜系B型病毒之間很少或者沒有交叉保護(hù)甲型和乙型流感病毒血凝素基因進(jìn)化樹四價流感疫苗背景目前六十二頁\總數(shù)七十一頁\編于九點(diǎn)批準(zhǔn)時間批準(zhǔn)單位生產(chǎn)廠家疫苗名稱疫苗類型使用方式適用人群2012年02月美國FDA阿斯利康旗下子公司MedImmuneFluMistQuadrivalentvaccine減毒活疫苗鼻腔噴霧2-49歲2012年12月美國FDA葛蘭素史克公司Fluarix裂解疫苗肌肉注射3歲以上2013年08月美國FDA葛蘭素史克公司FluLavalQuadrivalent裂解疫苗肌肉注射3歲以上2013年06月美國FDA賽諾菲巴斯德