抗生素發(fā)酵的過程

歐陽索引創(chuàng)編 2021.02.02現(xiàn)代抗生素工業(yè)生產(chǎn)過程如下：歐陽家百(2021.03.07)菌種-孢子制備-種子制備-發(fā)酵-發(fā)酵液預處理-提取及精制-成品包裝一、 菌種從來源于自然界土壤等，獲得能產(chǎn)生抗生素的微生物，經(jīng)過分離、選育和純化后即稱為菌種。菌種可用冷凍干燥法制備后，以超低溫，即在液氮冰箱(-190°C~-196°C)內保存。所謂冷凍干燥是用脫脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，經(jīng)真空冷凍、升華干燥后，在真空下保存。如條件不足時，則沿用砂土管在0C冰箱內保存的老方法，但如需長期保存時不宜用此法。一般生產(chǎn)用菌株經(jīng)多次移植往往會發(fā)生變異而退化，故必須經(jīng)常進行菌種選育和純化以提高其生產(chǎn)能力。北京天壇醫(yī)院呼吸內科郭偉二、 孢子制備生產(chǎn)用的菌株須經(jīng)純化和生產(chǎn)能力的檢驗，若符合規(guī)定，才能用來制備種子。制備孢子時，將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子，通過嚴格的無菌手續(xù)，將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上，在一定溫度下培養(yǎng)5-7日或7日以上，這樣培養(yǎng)出來的孢子數(shù)量還是有限的。為獲得更多數(shù)量的孢子以供生產(chǎn)需要，必要時可進一步用扁瓶在固體培養(yǎng)基（如小米、大米、玉米?；螓熎ぃ┥蠑U大培養(yǎng)。三、 種子制備其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，并接種到發(fā)酵罐中，種子制備可用搖瓶培養(yǎng)后再接入種子罐進逐級擴大培養(yǎng)。或直接將孢子接入種子罐后逐級放大培養(yǎng)。種子擴大培養(yǎng)級數(shù)的多少，決定于菌種的性質、生產(chǎn)規(guī)模的大小和生產(chǎn)工藝的特點。擴大培養(yǎng)級數(shù)通常為二級。搖瓶培養(yǎng)是在錐形瓶內裝入一定數(shù)量的液體培養(yǎng)基，滅菌后以無菌操作接入孢子，放在搖床上恒溫培養(yǎng)。在種子罐中培養(yǎng)時，在接種前有關設備和培養(yǎng)基都必須經(jīng)過滅菌。接種材料為孢子懸浮液或來自搖瓶的菌絲，以微孔差壓法或打開接種口在火焰保護下按種。接種量視需要而定。如用菌絲，接種量一般相當于0.1%—2%（接種量的％，系對種子罐內的培養(yǎng)基而言，下同）。從一級種子罐接入二級種子罐接種量一般為5%—20%，培養(yǎng)溫度一般在25—30°C。如菌種系細菌，則在32—37°C培養(yǎng)。在罐內培養(yǎng)過程中，需要攪拌和通入無菌空氣。控制罐溫、罐壓，并定時取樣作無菌試驗，觀察菌絲形態(tài)，測定種子液中發(fā)酵單位和進行生化分析等，并觀察無雜菌情況。種子質量如合格方可移種到發(fā)酵罐中。四、 培養(yǎng)基的配制在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，由于各菌種的生理生化特性不一樣，采用的工藝不同，所需的培養(yǎng)基組成亦各異。即使同一菌歐陽索引創(chuàng)編 2021.02.02種，在種子培養(yǎng)階段和不同發(fā)酵時期，其營養(yǎng)要求也不完全一樣。因此需根據(jù)其不同要求來選用培養(yǎng)基的成分與配比。其主要成分包括碳源、氮源、無機鹽類（包括微量元素）和前體等。（1） 碳源主要用以供給菌種生命活動所需的能量，構成菌體細胞及代謝產(chǎn)物。有的碳源還參與抗生素的生物合成，是培養(yǎng)基中主要組成之一，常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂類。對有的品種，為節(jié)約成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。使用葡萄糖時，在必要時采用流加工藝，以有利于提高產(chǎn)量。油脂類往往還兼用作消沫劑。個別的抗生素發(fā)酵中也有用麥芽糖、乳糖或有機酸等作碳源的。（2） 氮源主要用以構成菌體細胞物質（包括氨基酸、蛋白質、核酸）和含氮代謝物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。氮源可分成兩類：有機氮源和無機氮源。有機氮源中包括黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉（它如果經(jīng)精制以去除其中的棉酚后稱phamamedia）。玉米漿、蛋白胨、尿素、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉和菌絲體等。無機氮源中包括氨水（氨水既作為氮源，也用以調節(jié)pH），硫酸銨、硝酸鹽和磷酸氫二氨等。在含有機氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度較快，菌絲量也較多。（3） 無機鹽和微量元素抗生素產(chǎn)生菌和其他微生物一樣，在生長、繁殖和產(chǎn)生生物產(chǎn)品的過程中，需要某些無機鹽類和微量元素。如硫、磷、鎂、鐵、鉀、鈉、鋅、銅、鉆、錳等，其濃度與菌種的生理活性有一定影響。因此，應選擇合適的配比和濃度。此外，在發(fā)酵過程中可加入碳酸鈣作為緩沖劑以調節(jié)pH。前體在抗生素生物合成中，菌體利用它以構成抗生素分子中的一部分而其本身又沒有顯著改變的物質，稱為前體(precursor)。前體除直接參與抗生素生物合成外，在一定條件下還控制菌體合成抗生素的方向并增加抗生素的產(chǎn)量。如苯乙酸成苯乙酰胺可用作為青霉素發(fā)酵的前體。丙醇或丙酸可作為紅毒素發(fā)酵的前體。前體的加入量應當適度。如過量則往往前體有毒性，并增加了生產(chǎn)成本。如不足，則發(fā)酵單位降低。此外，有時還需要加入某種促進劑或抑制劑，如在四環(huán)素發(fā)酵中加入M-促進劑和抑制劑漠化鈉，以抑制金霉索的生物合成并增加四環(huán)素的產(chǎn)量。培養(yǎng)基的質量培養(yǎng)基的質量應予嚴格控制，以保證發(fā)酵水平，可以通過化學分析，并在必要時作搖瓶試驗以控制其質量。培養(yǎng)基的儲存條件對培養(yǎng)基質量的影響應予注意。此外，如果在培養(yǎng)基滅菌過程中溫度過高、受熱時間過長亦能引起培養(yǎng)基成分的降解或變質。培養(yǎng)基在配制時的調節(jié)其pH亦要嚴格按規(guī)程執(zhí)行。五、發(fā)酵(見手機電子書)發(fā)酵過程的目的是使微生物大量分泌抗生素。在發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基也必須先經(jīng)過滅菌后再接入種子。接種量一般為10%或10%以上，發(fā)酵期視抗生素品種和發(fā)酵工藝而定，在整個發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧，在罐的夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。此外，還要加入消沫劑以控制泡沫，必要時還加入酸、堿以調節(jié)歐陽索引創(chuàng)編 2021.02.02發(fā)酵液的PH。對有的品種在發(fā)酵過程中還需加入葡萄糖、銨鹽或前體，以促進抗生素的產(chǎn)生。對其中一些主要發(fā)酵參數(shù)可以用電子計算機進行反饋控制。在發(fā)酵期間每隔一定時間應取樣進行生化分析、鏡檢和無菌試驗。分析或控制的參數(shù)有菌絲形態(tài)和濃度、殘?zhí)橇俊被?、抗生素含量、溶解氧、pH、通氣量、攪拌轉速和液面控制等。其中有些項目可以通過在線控制。（在線即online，指不需取樣而直接在罐內測定，然后予以控制）。六、發(fā)酵液的過濾和預處理發(fā)酵液的過濾和預處理其目的不僅在于分離菌絲，還需將一些雜質除去。盡管對多數(shù)抗生素品種在生產(chǎn)過程中，當發(fā)酵結束時，抗生素存在于發(fā)酵液中，但也有個別品種當發(fā)酵結束時抗生素大量殘存在菌絲之中，在此情況下，發(fā)酵液的預處理應當包括使抗生素從菌絲中析出，使其轉入發(fā)酵液。（1）發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液中的雜質如高價無機離子（Ca+2、Mg+2、Fe+3）和蛋白質在離子交換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸附。如用溶媒萃取法提煉時，蛋白質的存在會產(chǎn)出乳化，用溶媒和水相分層困難。對高價離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質）凝固以提高發(fā)酵濾液的質量。如加磷酸（或磷酸鹽），則既能降低鈣離子濃度，也易于去處鎂離子。Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+Na+歐陽索引創(chuàng)編 2021.02.02如加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質。此外，這二者還有協(xié)同作用。它們所產(chǎn)生的復鹽對蛋白質有吸附作用。2K4Fe（CN）6+3ZnSO4—K2Zn3[Fe（CN）6]2J+3K2SO4某些對熱穩(wěn)定的抗生素發(fā)酵液還可用加熱法。使蛋白質變性而降低其溶解度。蛋白質從有規(guī)律的排列變成不規(guī)則結構的過程稱為變性。加熱還能使發(fā)酵液粘度降低、加快濾速。例如在鏈霉素生產(chǎn)中就可用加入草酸或磷酸將發(fā)酵液調至pH3.0左右，加熱至70°C，維持約半小時，用此方法來去除蛋白質，這樣濾速可增大10—100倍。濾液粘度可降低至1/6。如抗生素對熱不穩(wěn)定，則不應采用此法。為了更有效地去除發(fā)酵液中的蛋白質，還可以加入絮凝劑。它是一種能溶于水的高分子化合物。含有很多離子化基團，如一NH2—COOH，—OH等。如上所述，膠體粒子的穩(wěn)定性和它所帶電荷有關。由于同性電荷間的靜電斥力而使膠體粒子不發(fā)生）疑聚。絮）疑劑分子中電荷密度很高，它的加入使膠體溶液電荷性質改變從而使溶液中蛋白質絮凝。對絮）疑劑的化學結構一般有下列幾種要求：1）其分子中必須有相當多的活性基團，能和懸浮顆粒表面相結合。2）必須具有長鏈線性結構，但其相對分子質量（分子量）不能超過一定限度，以使其有較好的溶解度。在發(fā)酵濾液中多數(shù)膠體粒子帶負電荷，因而用陽離子絮）疑劑功效較高。例如可用含有季胺基團的聚苯乙烯衍生物，分子量在26000-55000范圍內。加入絮凝劑后析出的雜質再經(jīng)過濾除去，以利于以后的提取。（2）發(fā)酵液的過濾發(fā)酵液為非牛頓型液體、很難過濾。過濾的難易與發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件，以及是否染菌等因素有關。過濾如用板框壓濾則勞動強度大，影響衛(wèi)生，菌絲流入下水道時還影響污水處理。故以選用鼓式真空過濾機為宜，并在必要時在轉鼓表層涂以助濾劑硅藻土。當轉數(shù)旋轉時，以刮刀將助濾劑連同菌體薄薄刮去一層，以使過濾面不斷更新。七、抗生素的提取提取時目的是在于從發(fā)酵液中制取高純度的符合藥典規(guī)定的抗生素成品。在發(fā)酵濾液中抗生素濃度很低，而雜質的濃度相對地較高。雜質中有無機鹽、殘?zhí)?、脂肪、各種蛋白質及其降解物、色素、熱原質、或有毒性物質等。此外，還可能有一些雜質其性質和抗生素很相似，這就增加了提取和精制的困難。由于多數(shù)抗生素不很穩(wěn)定，且發(fā)酵液易被污染，故整個提取過程要求：1）時間短；2）溫度低；3）pH宜選擇對抗生素較穩(wěn)定的范圍；4）勤清洗消毒（包括廠房、設備、管路并注意消滅死角）。常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。今分述如下：（1）溶媒萃取法這是利用抗生素在不同pH條件下以不同的化學狀態(tài)（游離酸、堿或成鹽）存在時，在水及與水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素從一種液相例發(fā)酵濾液）轉移到另一種液相（如有機溶媒）中去，以達到濃縮和提純的目的。歐陽索引創(chuàng)編 2021.02.02利用此原理就可藉助于調節(jié)pH的辦法使抗生素從一個液相中被提取到另一液相中去。所選用的溶媒與水應是互不相溶或僅很小部分互溶，同時所選溶媒在一定的pH下對于抗生素應有較大的溶解度和選擇性，方能用較少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分離掉雜質。目前一些重要的抗生素，如青霉素、紅霉素和林可霉素等均采用此法進行提取。（2）離子交換法這是利用某些抗生素能解離為陽離子或陰離子的特性，使其與離子交換樹脂進行交換，將抗生素吸附在樹脂上，然后再以適當?shù)臈l件將抗生素從樹脂上洗脫下來，以達到濃縮和提純的目的。應選用對抗生素有特殊選擇性的樹脂，使抗生素的純度超過離子交換有較大的提高。由于此法具有成本低、設備簡單、操作方便，已成為提取抗生素的重要方法之一。如鏈霉菌素、慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素等均可采用離子交換法。此法也有其缺點，如生產(chǎn)周期長，對某些產(chǎn)品質量不夠理想。此外，在生產(chǎn)過程中PH變化較大，放不適用于在PH大幅度變化時，穩(wěn)定性較差的抗生素等。3.吸附法利用各種吸附劑（如活性炭、大孔樹脂等）吸附培養(yǎng)中的活性物質，而后用適宜的有機溶劑（如甲醇、丙酮）或它們的水溶液從吸附劑上洗脫活性物質。必要時可加入稀酸或稀氨水幫助洗脫。4.直接沉淀法有些活性物質（如四環(huán)素）可從培養(yǎng)液中借助pH的調節(jié)而沉淀下來；有的也可借加入與水相溶的有機溶劑（如丙酮）而沉淀；還有的可借加入某種離子與活性物質形成復合物而沉淀，例如四環(huán)類抗生素與尿素形成的復合物沉淀。該法是提取抗生素的方法中最簡單的一種。5.其他提取方法由于近年來許多抗生素發(fā)酵單位已大幅度提高，提取方法亦相應適當簡化。如直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最簡單的一種。例如四環(huán)類抗生素的提取即可用此法。發(fā)酵液在用草酸酸化后，加黃血鹽、硫酸鋅，過濾后得濾液，然后以脫色樹脂脫色后，直接將其PH調至等電點后使其游離堿折出。必要時將此堿轉化成鹽酸鹽。八、抗生素的精制這是抗生素生產(chǎn)最后工序。對產(chǎn)品進行精制、烘干和包裝的階段要符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范。（即GMP）的規(guī)定。例如其中規(guī)定產(chǎn)品質量檢驗應合格、技術文件應齊全、生產(chǎn)和檢驗人員應具有一定素質；設備材質不應能與藥品起反應、并易清洗，空調應按規(guī)定的級別要求，各項原始記錄、批報和留樣應妥為保存，對注射品應嚴格按無菌操作的要求等。下面對抗生素精制中可選用的步驟分述如下：A脫色和去熱原質脫色和去熱原質是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。它關系到成品的色級及熱原試驗等質量指標。色素往往是在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它與菌種和發(fā)酵條件有關。熱原質是在生產(chǎn)過程中由于被污染后由雜菌所產(chǎn)生的一種內毒素。各種雜菌所產(chǎn)生的熱原反應有所不同。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的熱原反應一般比革蘭氏陽性菌的為強。熱原注入體內引起惡寒高熱，嚴重的引起休克。它是多糖磷類脂質和蛋白質的結合體，為大分子有機物質，能溶于水。在280°C加熱4h它能被破壞90%；180—200°C加熱半小時或150C加熱2h能被徹底破壞。它亦能被強酸、強堿、氧化劑(如高錳酸酸鉀)等破壞。它能通過一般濾器，但能被活性炭、石棉濾材等所吸附。生產(chǎn)中常用活性炭脫色去除熱原，但須注意脫色時pH，溫度、炭用量及脫色時間等因素，還應考慮它對抗生素的吸附問題，否則能影此外，也可用脫色樹脂去除色素(如酚醛樹指，即122樹脂)。對某些產(chǎn)品可用超微過濾辦法去除熱源，此外還應加強在生產(chǎn)過程中的環(huán)境衛(wèi)生以防止熱原。響收率。B結品和重結晶抗生素精制常用此法來制得高純度成品。常用的幾種結晶方法如下：改變溫度結晶利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來進行結晶。例如制霉菌素的濃縮液在5C條