植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物

植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第1頁一

本節(jié)主要內(nèi)容毛狀根培養(yǎng)制備次級代謝產(chǎn)物二

本節(jié)關(guān)鍵問題1.毛狀根誘導(dǎo)機制與方法、應(yīng)用2.毛狀根培養(yǎng)制備次級代謝產(chǎn)物影響原因3.植物組織器官、細胞培養(yǎng)制備次級代謝產(chǎn)物各自優(yōu)缺點植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第2頁一

分化與次級代謝產(chǎn)物關(guān)系1

1.細胞分化與次生代謝產(chǎn)物細胞分化程度提升與次生代謝產(chǎn)物含量有一定相關(guān)性。比如：許多植物次生代謝產(chǎn)物合成與葉綠體分化相關(guān)。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第3頁2.細胞聚集和組織水平上分化在聚集細胞團塊中，位于表面和中央細胞處于不一樣分化狀態(tài)，從而常表現(xiàn)出與游離細胞不一樣次生代謝能力。比如：小果咖啡培養(yǎng)物中嘌呤環(huán)生物堿合成取決于細胞團塊大小。所以，固定化培養(yǎng)利于提升生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物含量。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第4頁3.器官水平上分化有些植物某種次生代謝產(chǎn)物在某個器官中含量較高，在懸浮培養(yǎng)細胞中含量較低或沒有。比如：柴胡根中含有效成份柴胡皂苷，其愈傷組織普通不能合成這類化合物。有些植物培養(yǎng)物在合成次級代謝產(chǎn)物時要求有芽形成。比如：長春花脫分化培養(yǎng)細胞中極難取得含有抗癌活性長春花堿，而在培養(yǎng)長春花簇芽中能測定出長春花堿。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第5頁大多數(shù)植物次級代謝產(chǎn)物與細胞分化相關(guān)。離體培養(yǎng)植物細胞存在不穩(wěn)定、目標產(chǎn)物含量低、需要激素等不足。所以，分化程度較高、遺傳更穩(wěn)定植物組織器官培養(yǎng)在有價值次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上展現(xiàn)了應(yīng)用潛力。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第6頁二

植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第7頁（一）毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物一些植物次級代謝產(chǎn)物在根里大量合成，不過正常根培養(yǎng)非常困難，生長遲緩，收獲困難。毛狀根(hairy

roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium

rhizogenes）感染雙子葉植物后，形成類似頭發(fā)一樣根組織。許多植物毛狀根在離體培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出次生代謝產(chǎn)物合成能力，產(chǎn)物產(chǎn)量較正常植物及懸浮培養(yǎng)細胞要高。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第8頁1.毛狀根產(chǎn)生機制發(fā)根農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumrhizogenes)是一個革蘭氏陰性菌，能侵染大多數(shù)雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個別裸子植物，誘發(fā)被感染植物受傷部位長出毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌含有致根性，是因為它具有能誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生Ri(Root）,inducing)質(zhì)粒（約250kb大質(zhì)粒）是位于發(fā)根農(nóng)桿菌染色體之外獨立雙鏈環(huán)狀DNA。含有2個主要功效區(qū)：T-DNA區(qū)(Transferred

DNA

region，轉(zhuǎn)移區(qū))和Vir區(qū)(Virulanee

region，致病區(qū))。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第9頁在通常狀態(tài)下，Ri質(zhì)粒上Vir區(qū)基因處于抑制狀態(tài)，當發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主植物時，受損傷植物細胞合成低分子苯酚化合物乙酰丁香酮使Vir區(qū)處于抑制狀態(tài)基因被激活，產(chǎn)生一系列限制性核酸內(nèi)切酶，在酶切割作用下產(chǎn)生T-DNA鏈，T-DNA進入植物細胞核內(nèi)，整合進植物細胞基因組。其整合和表示結(jié)果造成了大量毛狀根產(chǎn)生。T-DNA上有生長素合成基因tms

1和tms

2，指導(dǎo)IAA(吲哚乙酸)合成，所以轉(zhuǎn)化產(chǎn)生毛狀根，在培養(yǎng)時不需要添加外源生長激素，為激素自養(yǎng)型。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第10頁

2.毛狀根誘導(dǎo)方法（1）外植體接種法取植物葉片、莖段、葉柄等無菌外植體，與發(fā)根農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)2～3

天，將植物外植體移到含有抗生素選擇培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，經(jīng)過屢次繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植物細胞產(chǎn)生愈傷組織，并可產(chǎn)生毛狀根。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第11頁（2）莖桿接種法無菌植株生長到一定時候，將植株莖尖、葉片切去，剩下莖桿和根部，在莖桿上劃出傷口，將帶Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌接種在傷口處和莖頂部切口處，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，在接種部位產(chǎn)生毛狀根。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第12頁（3）原生質(zhì)體—農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法將原生質(zhì)體培養(yǎng)3-5天后，加入帶Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌進行共培養(yǎng)，然后借助于轉(zhuǎn)化后細胞激素自養(yǎng)型特征或T-DNA上抗菌素標識篩選出轉(zhuǎn)化成功細胞。分裂形成愈傷組織，在無激素培養(yǎng)基上可產(chǎn)生毛狀根。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第13頁3.毛狀根培養(yǎng)優(yōu)點由Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化毛狀根生長快、激素自養(yǎng)型、生長周期短，在培養(yǎng)時不需要添加外源激素，易于培養(yǎng)。毛狀根分化程度高，產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物能力強，合成較為穩(wěn)定，能大量合成一些懸浮培養(yǎng)細胞不能或者極少合成次級代謝產(chǎn)物。經(jīng)過T-DNA改造，易于采取基因工程路徑提升次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第14頁4.毛狀根在藥用次生代謝產(chǎn)物中應(yīng)用毛狀根應(yīng)用于藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)已經(jīng)有近30年歷史。黃酮類(flavonoids)：付春祥等研究表明。來源于新疆雪蓮根段外植體毛狀根系。其20d生長速率可到達鮮重接種量24倍。其中黃酮含量是野生雪蓮根8.6倍，是野生雪蓮葉片2.9倍。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第15頁生物堿類(alkaloids)：孫敏等以長春花(Catharanthus

roseus)無菌苗葉片為外植體誘導(dǎo)毛狀根，其中長春堿含量是原植物根和葉中含量27.4倍和23.5倍。長春新堿含量是原植物根是23.5倍。蒽醌類(anthraquinones):對何首烏(Polygoniummultiflorum

Thunb)研究表明：以再生植株葉柄、莖段和葉片為外植體可誘導(dǎo)毛狀根，毛狀根中大黃酸含量為2.49μg/L(干重)。是無菌幼苗2.85倍。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第16頁皂苷類(saponins)：對人參研究表明：以無菌苗帶葉幼莖為外植體誘導(dǎo)毛狀根中人參總皂苷含量為2.486％(干重)。高于原藥材總皂苷含量1.403％(干重)。苯丙素類(

類(phenyIpropanoids)：雪蓮毛狀根中丁香苷和高車前素含量分別約是野生植株40倍和3倍。萜類(terpenoids)：對短葉紅豆杉研究表明：以無菌苗芽為外植體可誘導(dǎo)出毛狀根。毛狀根中紫杉醇含量為愈傷組織1.3--8

8.0

0倍。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第17頁（二）冠癭組織培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物冠癭組織（Crown

galltissue）是由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染引發(fā)植物腫瘤組織，它能在無外加植物激素培養(yǎng)基上生長。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第18頁冠癭組織形成與根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium

tumefaciens）上Ti質(zhì)粒相關(guān)。Ti質(zhì)粒上也有一段特殊T-DNA，編碼細胞分裂素合成酶基因ipt(trnsr)以及生長素合成酶基因

iaaM(trns1)、iaaH(trns2)。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第19頁根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成冠癭組織過程與發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成毛狀根過程相同。T-DNA整合進植物細胞基因組后，生長素合成酶基因iaaM(trns1)、iaaH(trns2)分別表示色氨酸單加氧酶、吲哚乙酸酰胺水解酶，二者共同作用合成生長素吲哚-乙酸（IAA）。細胞分裂素合成酶基因

因ipt(trnsr)

)表示異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，催化合成份裂素2-異戊烯基腺嘌呤（ZIP）。T-DNA指導(dǎo)生長素與分裂素合成造成了轉(zhuǎn)化植物形成冠癭組織。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第20頁冠癭組織培養(yǎng)不但能夠生產(chǎn)植物根中產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，而且能夠制備植物葉中代謝產(chǎn)物，國外利用冠癭組織培養(yǎng)制備了喹啉生物堿，我國也已經(jīng)開展西洋參冠癭組織培養(yǎng)制備人參皂苷研究。Ti質(zhì)粒另外一個應(yīng)用：構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第21頁三

毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)藥用次級代謝產(chǎn)物討論分析植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第22頁1.長春花堿毛狀根培養(yǎng)制備長春花（Catharanthus

roseus

(L.)

Don）：夾竹桃科長春花屬。長春花姿態(tài)優(yōu)美，花期長，適合布置花壇、花境，也可作盆栽觀賞。還是一個防治癌癥藥源植物。長春花中含55種生物堿。其中長春堿和長春新堿對治療絨癌等惡性神瘤、淋巴肉瘤及兒童急性白血病等都有一定療效（長春新堿抗癌比長春堿高強）。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第23頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第24頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第25頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第26頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第27頁2.雪蓮花毛狀根培養(yǎng)制備黃酮植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第28頁發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)水母雪蓮葉片21d時到達最大值，為633mg/L植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第29頁氮源總濃度為30mmo1/L時，毛狀根生長量和總黃酮合成量均到達最大，分別為7.3g/L(DW)和617mg/L;NH4+

/N03-百分比為5:25時，毛狀根生長量和總黃酮合成量均到達最大，分別為8.0g/L(DW)和821mg

/L植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第30頁50mg/L葡萄糖效果最好，毛狀根干重和總黃酮合成量分別到達7.6g/L(DW)和773mg/L;20mg/L蔗糖和30mg/L葡萄糖組合時，毛狀根生長量到達7.6g/L(DW)，總黃酮合成量到達850mg/LNOTE：G:葡萄糖；S:蔗糖植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第31頁G

A3（赤霉素）對水母雪蓮毛狀根側(cè)根產(chǎn)生有強烈促進作用，GA3濃度為0.5mg/L時，毛狀根生長量到達9.1g/L(DW)，是基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下1.2倍;總黃酮合成量到達936mg/L。0.5mg/LGA3和0.5mg/LIBA（3-吲哚丁酸）組合對毛狀根生長和總黃酮合成最有利，生長量為12.6g/L(DW)，比基本培養(yǎng)條件時提升了70%;總黃酮合成量為1287mg/L。NOTE：NAA(萘乙酸)；

IBA(3-吲哚丁酸)；

IAA（吲哚乙酸）；

BA（6-芐氨基嘌呤）植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第32頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第33頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第34頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第35頁植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第36頁結(jié)論上節(jié)例子反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細胞：3.0%黃酮植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第37頁3.討論現(xiàn)實狀況：

當前轉(zhuǎn)化成功毛狀根植物有200各種，但怎樣使其規(guī)?；a(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物報道較少。課堂討論題：你認為植物毛狀根培養(yǎng)最大限制或問題在哪里？植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第38頁毛狀根生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物影響原因當前制約毛狀根在藥用植物有效成份生產(chǎn)中應(yīng)用主要原因：毛狀根誘導(dǎo)率毛狀根發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)：一些物理原因(如光強、溫度)和化學(xué)原因(如培養(yǎng)基、碳源、氮源、激素、前體、誘導(dǎo)子等)均會對毛狀根增殖和次生代謝物質(zhì)合成產(chǎn)生影響。生物反應(yīng)器生物合成路徑不清楚植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第39頁（1）生物原因毛狀根誘導(dǎo)及高產(chǎn)單克隆根系篩選：A不一樣誘導(dǎo)對象B不一樣誘導(dǎo)方法C生長速度、特征（比如：結(jié)團性、耐受剪切力）D產(chǎn)物含量E穩(wěn)定性植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第40頁（2）化學(xué)原因A碳源：

作為供給毛狀根碳源糖類較多，但對不一樣單糖、雙糖怎樣影響毛狀根生長及其產(chǎn)物合成了解較少。

對于甜菜毛狀根，蔗糖能夠快速被利用，其次為麥芽糖；葡萄糖只能被有限地利用；果糖、乳糖、半乳糖、木糖、甘油既能抑制毛狀根生長，也能抑制甜菜色有合成。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第41頁B氮源：

常采取無機氮源主要是硝酸鹽和銨。硝酸鹽和銨對毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物合成產(chǎn)生較為主要調(diào)控作用，所以硝酸鹽和銨百分比、總添加量、添加時間對毛狀根影響值得研究。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第42頁C激素：對根生長產(chǎn)生影響，激素也影響到根中乙烯生物合成。

激素與T-DNA區(qū)基因相互作用也起到很大作用，比如：發(fā)根(rol)基因控制激素代謝和生理代謝，而激素又刺激rol基因表示.植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第43頁D誘導(dǎo)子：

誘導(dǎo)子

(elicitors)主要是引發(fā)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)物質(zhì)，因為誘導(dǎo)子能引發(fā)植物休內(nèi)特殊次生代謝物積累，所以被用于毛狀根培養(yǎng)。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第44頁E前體：

添加對應(yīng)前體可能會增加產(chǎn)物產(chǎn)量，如甜菜毛根合成甜菜色苷代謝過程最終一步主要由甜菜醛氨酸與氨基酸合成了甜菜色苷，所以添加氨基酸對提升甜菜色苷產(chǎn)量有幫助。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第45頁F過氧化物酶：

毛狀根中一些過氧化物酶類與次生代謝產(chǎn)物降解有著親密聯(lián)絡(luò)，怎樣減低這類氧化酶活性從而提升次生代謝產(chǎn)物在毛狀根中積累量是值得關(guān)注又一熱點。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第46頁（3）物理原因A光質(zhì)：

可見光包含不一樣波長光線，所以應(yīng)該考慮光源對毛狀根生長和合成次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。

比如：在660nm波長光線下，青篙毛狀根干重和青篙素含量都到達最大。光敏色素在紅光照射下成為激活狀態(tài)，使得一些酶酶活發(fā)生改變，次生代謝產(chǎn)物合成路徑因而受到調(diào)整。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第47頁B溫度：

因為正常植物一天當中受到不一樣溫度、光強度影響，次生代謝改變可能會很大，所以研究溫度模式對毛狀根生長和次生代謝影響則顯得較為主要。高麗參毛狀根研究表明，20℃

(白天)/13℃

(夜晚)處理，高麗參毛狀根生物量以及人參皂苷產(chǎn)量到達最大。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第48頁（4）毛狀根培養(yǎng)生物反應(yīng)器毛狀根外型像毛發(fā)，輕易交織纏繞。毛狀根特點決定了用于毛狀根培養(yǎng)生物反應(yīng)器需要特殊設(shè)計。比如：反應(yīng)器內(nèi)部需要特殊設(shè)計滿足毛狀根空間分布均勻性問題。同時，也要提供合適培養(yǎng)液循環(huán)與氣體供給方式才能滿足毛狀根對營養(yǎng)和氣體需求，還要考慮接種、取樣、收獲、生物量檢測等特殊問題。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第49頁傳統(tǒng)反應(yīng)器改造在攪拌式反應(yīng)器中用絲網(wǎng)把毛狀根與葉輪隔開，防止了葉輪剪切力影響。在鼓泡塔反應(yīng)器中增加大量噴頭，提升了充氧效率。植物組織器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物第50頁新型反應(yīng)器設(shè)計:超聲霧化反應(yīng)器1生物反應(yīng)器2中