免疫試驗專題知識講座

免疫試驗專題知識講座免疫試驗專題知識講座第1頁免疫學檢測技術分類

抗原抗體反應凝集反應（試管凝集試驗）沉淀反應（雙向免疫擴散試驗）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

淋巴細胞檢測技術外周血單個核細胞分離試驗小鼠腹腔巨噬細胞分離及免疫細胞化學染色試驗

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗補體依賴細胞毒試驗（CDC）細胞因子檢測技術免疫學常見分子生物學技術免疫試驗專題知識講座第2頁

試驗匯報書寫標準試驗題目：單核細胞分離試驗時間：.3.28試驗目標：分離人類外周血單核細胞試驗原理：因為不一樣細胞密度不一樣，所以可利用密度梯度離心法將不一樣比重細胞分開。試驗材料：試管、抗凝血試驗步驟與結果：肉眼可見灰白層，1ml血收獲xx細胞。結果分析：此次分離細胞較正常人單個核細胞數(shù)少，可能原因一是試驗誤差所致，二是該患者為白細胞降低癥。免疫試驗專題知識講座第3頁試驗設計標準研究題目：確定研究題目是開展研究工作首要任務。研究摘要：研究背景，要開展主要研究（能夠敘述利用什么樣方法開展研究），研究意義（此次研究預期結果及其推進科學進步作用）。研究內容：敘述主要開展工作。研究方案：利用什么樣伎倆去處理研究內容提到相關工作。研究特色與創(chuàng)新之處：主要科學貢獻。免疫試驗專題知識講座第4頁題目：XX細胞因子誘導肺癌細胞凋亡作用及其機制研究摘要：肺癌是最常見腫瘤之一。XX與各種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關，但其在肺癌中作用仍缺乏報道。本研究采取人肺癌細胞，利用流式細胞術分析XX誘導人肺癌細胞凋亡作用，經過分析Caspase3,8,12等確定XX誘導腫瘤細胞凋亡機制。本研究不但能夠深入揭示XX抗腫瘤作用機制，也為尋找新肺癌治療方法提供研究基礎。研究內容：1）XX在人肺癌腫瘤細胞表示分析，確定XX表示與肺腫瘤關系。2）檢測患者血清XX水平，確定其輔助診療肺癌價值研究方案：1）采取腫瘤組織切片，經過免疫細胞化學染色觀察XX在人肺癌組織中表示情況。2）采取ELISA法檢測血清XX水平。研究特色與創(chuàng)新之處：本研究闡述了XX與肺癌關系，并提出XX可作為肺癌血清學診療標志物，研究發(fā)覺XX能夠誘導肺癌細胞凋亡，并闡述了其作用機制。免疫試驗專題知識講座第5頁試驗設計考試腫瘤患者存在各種免疫異常，請設計一個試驗分析腫瘤患者體內巨噬細胞功效。主要包含

1）題目

2）研究內容①②③

3）研究方案①②③

4）預期結果免疫試驗專題知識講座第6頁級五年制本科生

免疫學試驗課主講：倪維華Email:niwh5566@免疫試驗專題知識講座第7頁試管凝集—測定血型抗體效價

雙向免疫擴散

試驗內容免疫試驗專題知識講座第8頁抗原抗體反應分類凝集反應瓊脂沉淀反應中和反應補體結合反應環(huán)狀法絮狀法沉淀反應單向免疫擴散、雙向免疫擴散對流免疫電泳、火箭電泳免疫電泳反應分類免疫試驗專題知識講座第9頁試驗原理:在試管中，顆粒性抗原與對應抗體在有適量電解質存在時，直接結合可形成肉眼可見凝集塊。試管凝集—測定血型抗體效價免疫試驗專題知識講座第10頁試驗目標利用凝集試驗判斷抗體效價效價：也稱滴度，它表示法與抗體稀釋倍數(shù)相關，普通以該抗體能與其對應抗原發(fā)生可見反應最高稀釋度來表示。免疫試驗專題知識講座第11頁試驗材料名稱量/組生理鹽水20ml0.5%壓積血（RBC）8ml抗體1ml1ml刻度吸管2支1ml加樣器1支1ml加樣器頭若干小試管28支(7支/人)試管架1個37℃孵箱1個/室記號筆1只試驗以個人為單位，物品四個人一組免疫試驗專題知識講座第12頁試驗步驟抗體倍比稀釋。稀釋好試管中各加入紅細胞0.5ml。加樣后搖動試管，使紅細胞與血清充分混合。37℃孵育90mins后進行結果觀察。試管號1234567抗體(血清)0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml-抗原(紅細胞)0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml血清稀釋度1/1201/2401/4801/9601/19201/3840-免疫試驗專題知識講座第13頁抗體(血清)倍比稀釋方法取七只抗體稀釋管，編號。每只管中先加入生理鹽水0.5ml。取0.5ml血清加入第一管中，混勻后取出0.5ml加入第二管，依這類推。第7管為陰性對照，不加抗體（血清）。0.5ml生理鹽水1/601/1201/2401/4801/9601/1920-1/30血清1234567

免疫試驗專題知識講座第14頁操作前清點好試驗物品、器材。吸抗體與紅細胞加樣器頭不能混用。觀察結果時不要搖動試管。注意事項免疫試驗專題知識講座第15頁凝集程度判定：4＋：紅細胞全部凝集，上清澄清，晃動時凝集物成片狀分散3＋：紅細胞絕大個別凝集，上清較澄清2＋，紅細胞半數(shù)凝集，上清略澄清＋，紅細胞少數(shù)凝集，肉眼可見小凝塊±，紅細胞極少數(shù)凝集，顯微鏡下可見凝集－：無凝集，紅細胞在管底成界限清楚小圓點陰性對照：第7管（無抗體）為陰性對照血型抗體效價判定：肉眼可見凝集（＋）時血清最高稀釋度為血型抗體效價結果判定方法免疫試驗專題知識講座第16頁預期試驗結果免疫試驗專題知識講座第17頁雙向免疫擴散試驗免疫試驗專題知識講座第18頁雙向免疫擴散免疫試驗專題知識講座第19頁雙向免疫擴散應用

抗體效價判定檢測體液中各種蛋白成份免疫試驗專題知識講座第20頁實驗材料試劑：1.5%瓊脂 300ml/room抗OVA抗體1份/組BSA1份/組抗原(0.1mg/mlOVA)1份/組器材：5ml刻度吸管 1支/組20lpipette 1把Tip(小) 若干1.5mlEP管 10個培養(yǎng)箱37℃

1個/室濕盒 1個/室打孔器 1個打孔紙樣 1個免疫試驗專題知識講座第21頁試驗步驟玻片正面標識組別用5ml吸管吸收預熱1.5%瓊脂4ml冷卻后按紙樣打孔，每塊載玻片打兩組孔，加樣濕盒中反應（overnight)37℃NOTE:加樣時應將加樣器頭插入孔底，遲緩加入液體，直到孔滿（約8-10ul）1抗OVA抗體OVABSABSAOVA抗OVA抗體免疫試驗專題知識講座第22頁注意事項在玻片正面做好標識，玻片應水平放置。瓊脂一定加熱均勻后再進行鋪膠。鋪膠動作要快，均勻、厚薄一致。加樣時樣品量要適當，注意不要使樣品溢出。吸抗體和抗原槍頭不能混用。免疫試驗專題知識講座第23頁

抗原－抗體反應淋巴細胞檢測技術細胞因子檢測技術免疫學常見分子生物學技術免疫學檢測技術免疫試驗專題知識講座第24頁抗原抗體反應凝集反應沉淀反應免疫標識技術免疫試驗專題知識講座第25頁抗原抗體反應特點1.

抗原與抗體結合是特異性

﹡交叉反應2.

抗原抗體結合是可逆引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力斥力：電子云產生排斥力3.

抗原抗體反應可分為兩個階段抗原抗體特異性結合階段可見反應階段4.

抗原抗體分子百分比與抗原抗體結合是否展現(xiàn)可見反應現(xiàn)象親密相關

1.

抗原與抗體結合是特異性

﹡交叉反應2.

抗原抗體結合是可逆引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力斥力：電子云產生排斥力3.

抗原抗體反應可分為兩個階段抗原抗體特異性結合階段可見反應階段4.

抗原抗體分子百分比與抗原抗體結合是否展現(xiàn)可見反應現(xiàn)象親密相關

1.

抗原與抗體結合是特異性

﹡交叉反應2.

抗原抗體結合是可逆引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力斥力：電子云產生排斥力3.

抗原抗體反應可分為兩個階段抗原抗體特異性結合階段可見反應階段4.

抗原抗體分子百分比與抗原抗體結合是否展現(xiàn)可見反應現(xiàn)象親密相關

免疫試驗專題知識講座第26頁抗體過剩區(qū)抗原過剩區(qū)等價區(qū)免疫試驗專題知識講座第27頁抗原-抗體反應受各種原因影響電解質：抗原-抗體反應通常應用0.85%氯化鈉作為稀釋液，以供給適應濃度電解質。溫度：普通常使反應在37度水浴或孵育箱中進行。酸堿度：抗原-抗體反應適應酸堿度為PH6~8。免疫試驗專題知識講座第28頁凝集反應

(Agglutination)

細菌、紅細胞等顆粒性抗原或吸附于顆粒上可溶性抗原（或抗體）中加入對應抗體（或抗原），在電解質存在條件下形成凝集物現(xiàn)象，稱為凝集反應。

免疫試驗專題知識講座第29頁凝集反應分類直接凝集反應間接凝集反應間接凝集抑制試驗協(xié)同凝集試驗抗球蛋白試驗免疫試驗專題知識講座第30頁直接凝集試驗

（DirectAgglutination）

細菌或紅細胞等顆粒性抗原與對應抗體直接反應，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。

1.玻片法：定性試驗菌種判定及血型判定

2.試管法：半定量試驗抗體效價滴定免疫試驗專題知識講座第31頁間接（被動）凝集反應

（Indirect/PassiveAgglutination）

將可溶性抗原（或抗體）吸附于一個與免疫無關、一定大小載體表面，然后與對應抗體（或抗原）作用，在電解質存在條件下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。免疫試驗專題知識講座第32頁間接凝集抑制試驗

（IndirectAgglutinationInhibition）

可溶性抗原與對應抗體充分作用后，再加入抗原致敏載體顆粒，此時因抗體已被可溶性抗原結合，不會再出現(xiàn)載體凝集現(xiàn)象。免疫試驗專題知識講座第33頁協(xié)同凝集試驗

（Coagglutination）

金黃色葡萄球菌細胞壁中A蛋白（SPA）能與人及哺乳動物血清中IgG類抗體Fc段結合。IgGFc段與SPA結合后，其Fab段與特異性抗原結合出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。檢測血液、腦脊液及其它分泌液中微量抗原。

免疫試驗專題知識講座第34頁免疫試驗專題知識講座第35頁抗球蛋白試驗

（AntiglobulinTest，Coomb‘sTest）

一些血球凝集反應，如Rh＋紅細胞與抗Rh抗體反應，因抗體為IgG，結合價為兩價，與IgM相比，分子較小，抗體與紅細胞間結協(xié)力不能克服細胞間排斥力，不出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。若加入抗IgG抗體，則能夠在包被了Rh抗體紅細胞之間建立數(shù)量較多、距離較遠、因而排斥力較小聯(lián)接，引發(fā)凝集現(xiàn)象。免疫試驗專題知識講座第36頁免疫試驗專題知識講座第37頁沉淀反應

（Precipitation)

血清、蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與對應抗體在電解質存在條件下結合出現(xiàn)沉淀物，這一類反應稱為沉淀反應。大多沉淀反應是用半固體瓊脂凝膠為介質，進行瓊脂擴散故也稱免疫擴散。

免疫試驗專題知識講座第38頁沉淀反應分類雙向免疫擴散單向免疫擴散對流免疫電泳火箭電泳免疫電泳免疫試驗專題知識講座第39頁雙向免疫擴散

（DoubleImmunodiffusion)

在瓊脂板上按一定距離打兩個小孔，將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在百分比適當處形成沉淀線。假如反應體系中含兩種以上抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上沉淀線。本法常見于抗原或抗體定性、組成檢測。免疫試驗專題知識講座第40頁

在中間孔加入定量抗體，按一定距離在四面打數(shù)個小孔，分別加入不一樣稀釋度抗原，可形成粗細不等沉淀線，從而可判定抗體效價。雙向免疫擴散(DoubleImmunodiffusion)免疫試驗專題知識講座第41頁定性試驗