多聚酶鏈式反應擴增片段

關于多聚酶鏈式反應擴增片段第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月溫故知新1:組成DNA分子的基本單位是什么?這些基本單位是如何連接成DNA分子的?DNA分子結構有什么特點？第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月12345DNA的基本單位－脫氧核苷酸第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結構簡圖磷酸二酯鍵第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月ATGCAGCTDNA分子的平面結構氫鍵5'端3'端5'端3'端第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子的復制過程是怎樣的？DNA分子的復制需要哪些條件？溫故知新2第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA母鏈：提供復制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸DNA復制的條件第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸一、基礎知識

（一）PCR原理：第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①在80～100℃的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性3、PCR原理②當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化4、TaqDNA聚合酶的應用5、緩沖液需要為PCR反應提供的物質DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出6、PCR技術的特點第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①PCR過程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸7、細胞內復制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞內DNA的復制PCR不同點解旋解旋酶，邊解旋邊復制80～100℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)（先導鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接（滯后鏈）兩條子鏈均連續(xù)合成相同點①需要提供DNA復制模板②四種脫氧核苷酸作為原料③子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端細胞內DNA的復制與PCR的比較第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術的原理總結利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結合，從而完成體外DNA分子的擴增。體外DNA復制的條件：四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴格控制溫度的溫控設備。復制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）PCR的反應過程1、PCR的反應步驟PCR一般經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備2、循環(huán)過程第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月②復性（退火）模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月③延伸DNA模板－引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量1

22

43

820

1,048,57630

1,073,741,824第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應過程小結5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月5引物15引物2第二次復制第一次復制55

55

5

5模板DNA55

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5525～30次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月每個循環(huán)包括：變性——復性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也可以作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。PCR的反應過程：第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設備第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR的實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR儀第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月微量離心管微量移液器第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月1、準備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4、離心5、反應②離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR三步曲預變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復性55℃30s94℃5min第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月循環(huán)數(shù)變性復性延伸預變性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭第39頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關第40頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月稀釋2μLPCR反應液，加入98L蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零測定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過程第41頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月比色杯第43頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗小結

PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（