基因擴(kuò)增技術(shù)

生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)基因擴(kuò)增技術(shù)BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE21概念提出聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。能使人們?cè)趲仔r(shí)內(nèi)從試管中獲得大量的特異的核酸片段。臨床實(shí)驗(yàn)室主要用于對(duì)病毒、細(xì)菌、支原體及其它病原體的檢測(cè)。1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。2PCR反應(yīng)基本原理PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制基本相似。每一次循環(huán)復(fù)制包括3個(gè)步驟：

1.變性2.退火3.延伸2PCR反應(yīng)基本原理2.退火（annealing）即在較低的溫度(40~70℃)下使加入的引物與待擴(kuò)增的DNA區(qū)域特異性結(jié)合，以提供DNA復(fù)制起始的3’-OH端。3.延伸（extension）即在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?0℃～75℃），DNA聚合酶特異性結(jié)合到DNA模板上的引物的3’-OH端，以dNTP為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，進(jìn)行DNA鏈的延伸，即合成DNA新鏈。1.變性（denature）通過加熱至95℃左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成DNA單鏈模板而游離于反應(yīng)體系中，此過程稱為變性。2PCR反應(yīng)基本原理上述3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，使得特定長(zhǎng)度的靶DNA數(shù)量呈指數(shù)上升。在理論上，終產(chǎn)物DNA的量可用Yn=X·2n計(jì)算。3PCR反應(yīng)體系

PCR的反應(yīng)體系模板就是被復(fù)制的核酸片段引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，為化學(xué)合成的寡核苷酸可穩(wěn)定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性,

MgCl2濃度一般為1.5mmol/L為宜在擴(kuò)增過程中，當(dāng)溫度上升至72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH在7.2左右。其它反應(yīng)因素引物模板鎂離子濃度即dNTP為dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物脫氧核苷三磷酸（dNTP）催化DNA合成，即在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，使DNA鏈沿5′→3′方向延伸。TaqDNA聚合酶BEAFCD4PCR反應(yīng)注意事項(xiàng)1．實(shí)驗(yàn)室的布局要求劃分操作區(qū)。2．操作人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)。3．分裝試劑PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。4．實(shí)驗(yàn)操作注意安全防護(hù)。5．標(biāo)本收集建立標(biāo)本收檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序并對(duì)標(biāo)本采集人員進(jìn)行培訓(xùn)。6．標(biāo)本的保存和運(yùn)輸標(biāo)本應(yīng)新鮮，不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)置－20℃以下保存。5熒光PCR利用Taq酶的5′→3′外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針。熒光定量PCR基本原理根據(jù)上述原理研制了定量PCR擴(kuò)增儀，當(dāng)熒光信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值（Ct值）就被記錄下來。Ct值與標(biāo)準(zhǔn)模板數(shù)量的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用系列標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測(cè)樣品起始的DNA數(shù)量。6PCR反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用①人類遺傳疾病的診斷與研究，如地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥等致病基因的檢測(cè)；②病原體的檢測(cè)，包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體以及原蟲等的檢測(cè)，用于