核酸檢測技術(shù)

關(guān)于核酸檢測技術(shù)第1頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸檢測技術(shù)直接對動(dòng)植物有害生物基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。核酸的分離純化PCR技術(shù)核酸雜交技術(shù)第2頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第1節(jié)核酸的分離純化第3頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的分離純化的原則保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性提高核酸制品的純度第4頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)路線的設(shè)計(jì)第5頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月破碎細(xì)胞的方法機(jī)械（勻漿、超聲破、研磨等）非機(jī)械（化學(xué)處理、生化法）第6頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀是濃縮核酸最常用且高效的方法。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)乙醇對鹽類沉淀少，易揮發(fā)除去，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要量大，低溫操作異丙醇需體積小，速度快，一般不需低溫長時(shí)間放置易使鹽類、糖類與DNA共沉淀；異丙醇難以揮發(fā)除去第7頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸濃度檢測與完整性測定方法濃度測定

紫外分光光度法260nm

熒光光度法

EB熒光完整性測定瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果為依據(jù)?；蚪MDNA片段如發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀；完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值第8頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月問題一：DNA樣品不純

抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)DNA提取常見問題第9頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA提取常見問題問題二：DNA降解第10頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少第11頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月真菌昆蟲第12頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第2節(jié)PCR擴(kuò)增技術(shù)PCR,a‘DNAphotocopier’第13頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……第14頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明第15頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月KaryB.Mullis（1944－）1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第16頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1.PCR的基礎(chǔ)第17頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PolymeraseChainReactionPCRTheonlyenzymeusedinthisreactionisDNApolymerase.第18頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PolymeraseChainReactionTheproductsofthefirstreactionbecomesubstratesofthefollowingone,andsoon.PCR第19頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PolymeraseChainReactionPCRComponents：ThermostableDNAPolymerase，TargetDNA，PairofPrimers，dNTPs，Mg++ions，Buffersolution

第20頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Denaturation：ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg2+.ThePCRcycle:ThreedifferentstepsineachPCRcycle第21頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的擴(kuò)增？第22頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月HowdoesPCRworkThefirstcycleThesecondcycle第23頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月HowdoesPCRworkThethirdcycleThefourthcycle第24頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2.PCR的類型第25頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月多重PCR（multiplexPCR）巢式PCR（nestedPCR）定量PCR（quantitativePCR）不對稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR）OverlapPCR……第26頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCRusingseveralprimerpairsSIMULTANEOUSLYTypicallygeneratesaproductbandforeachprimerpair多重PCR（multiplexPCR）:What2.1多重PCR（multiplexPCR）第27頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月MultiplexPCR:WhyDetectseveralgenesatonceeg.transgenicplantscreenInternalcontrolsVERYimportantTellsyouhowwellthePCRreactionworkedReduces“falsenegatives”Reduces“falsepositives”多重PCR（multiplexPCR）第28頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月MultiplexPCR:HowSameasregularPCRCareinprimerdesignMuchgreaterchanceofprimer-dimersMuchgreaterchanceofartifactsAnnealingtemperaturesmustbeclose多重PCR（multiplexPCR）第29頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ATypicalMultiplexPCRReactionSterileWater34.0ul10XPCRBuffer5.0ulMgCl2(50mM)2.5uldNTP’s(10mMeach)1.0ulPrimer1FWD1.0ulPrimer1REV1.0ulPrimer2FWD1.0ulPrimer2REV1.0ulPrimer3FWD1.0ulPrimer3REV1.0ulDNAPolymerase0.5ulDNATemplate1.0ulTotalVolume50.0ul多重PCR（multiplexPCR）第30頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月MultiplexPCR:ExampleThreeprimerpairsControl,resistance,andtraitgenesControlgenefragmentislargestand(almost)faintestTraitgeneissmallestandbrightestResistanceGeneTraitGeneControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）第31頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月MultiplexPCR:ExampleThreeprimerpairsResistanceGeneTraitGeneWhicharetransgenic?ControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）第32頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月NestedMultiplexPCR2ndStagePCRDilute100foldBetween1st&2ndstagereactions1F1R2R3R5R6R3F2F6F4F5F4RPrimaryMultiplexRT-PCR多重PCR（multiplexPCR）第33頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2定量PCR（quantitativePCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealtimeQuantitativePCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCRmonitorsthefluorescenceemittedduringthereactionasanindicatorofampliconproductionateachPCRcycle(inrealtime)asopposedtotheendpointdetection第34頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測第35頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）定量原理三個(gè)概念：

擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析第37頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR原理——擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件第38頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期和平臺(tái)期。Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）基線期平臺(tái)期平臺(tái)期第39頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR原理——熒光域值Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）基線期指數(shù)擴(kuò)增期平臺(tái)期熒光域值手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段第40頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR原理——Ct值PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t)value第41頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性第42頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月定量原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率第43頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增效率E（amplificationefficiency）一個(gè)循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個(gè)循環(huán)的模板量的比值，其值位于0到1之間。在PCR的前20或30個(gè)循環(huán)中，E值比較恒定，為指數(shù)擴(kuò)增期，隨后E值逐步降低，直至0，此時(shí)PCR達(dá)到平臺(tái)期，不再擴(kuò)增。擴(kuò)增效率的計(jì)算可以采用系列稀釋法，將稀釋后濃度的對數(shù)值與所得Ct值做圖，在一定范圍內(nèi)應(yīng)該是得到一條直線，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K為該直線斜率）即可計(jì)算出E值。第44頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)

CT=-klgX0+b（線性方程）LogX0濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。第45頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線：CT值對[DNA]0作圖第46頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration第47頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）熒光定量PCR的化學(xué)原理1.Hydrolysisprobes（水解探針）(TaqMan,Beacons)2.DNA-binding(intercalating)agents（結(jié)合）(SYBRGreen,EvaGreen,LCGreen)3.HybridizationorFRETprobes（雜交）(LightCycler)第48頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon4、AmplisensorQQRDNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記第49頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreen法SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。信號強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。SYBRGreen第50頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation第51頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)

對DNA模板沒有選擇性

適用于任何DNA

使用方便

不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高缺點(diǎn)第52頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Tm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)第53頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan法TaqMan水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第55頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光第56頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

對目標(biāo)序列的高特異性

陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對簡單

與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)第57頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第58頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Title=(Real-timePCR)Timespan=2009-2012.PublishedItemsinEachYear第59頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ExamplesofSYBRGreenreal-timePCRassaysfordetectionofplantpathogenicfungi(last6years)第60頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）定量方法

絕對定量（AbsoluteQuantification）確定未知樣本中某個(gè)核酸序列的絕對量值，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量（RelativeQuantification）測定一個(gè)測試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對變化。

2-△C（t）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法第61頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月相對定量中的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA第62頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第63頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月

相對定量：參照因子Calibrator

第64頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月

相對定量分析方法1-ΔΔCt

第65頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第66頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同第67頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性

重復(fù)性

靈敏度其他問題常見問題討論第68頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增的特異性引物？Tm，重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化條件Tm第69頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月重復(fù)性判斷實(shí)驗(yàn)優(yōu)劣的重要指標(biāo)判斷指標(biāo)：主要為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）影響重復(fù)性的因素：PCR反應(yīng)擴(kuò)增的效率：優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。目的基因的初始濃度：使用初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本或作平行孔。標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響：不少于5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍；理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，質(zhì)粒DNA或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA。第70頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月影響靈敏度的因素反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍?？梢允褂脽釂?dòng)辦法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進(jìn)行擴(kuò)增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)數(shù)

Mg2＋的濃度

第71頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q1:無Ct值（信號）出現(xiàn)可能性不大檢測熒光信號的步驟有誤:一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號。引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。模板量不足:對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。第72頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR產(chǎn)物太長:一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。第73頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳加樣存在誤差:使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解:應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。引物或探針不佳:重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針模板中存在抑制物，或模板濃度過高。第74頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q4:陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛反應(yīng)mix或水被污染。引物二聚體的出現(xiàn)：用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。反應(yīng)過程中探針的降解：用PAGE電泳對探針進(jìn)行檢測。ROX校正的問題：如果使用了，則可能是ROX的降解所造成。第75頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q5:熔解曲線不止一個(gè)主峰引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。第76頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Q6:擴(kuò)增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。第77頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月兩步擴(kuò)增反應(yīng)Real-timeqPCR:循環(huán)數(shù)Step溫度時(shí)間檢測說明1195℃2minOff起始模板預(yù)變性35-45195℃15secOff模板變性260-68℃20-60secOn退火/延伸三步擴(kuò)增反應(yīng)Real-timeqPCR:循環(huán)數(shù)Step溫度時(shí)間檢測說明1195℃2minOff起始模板預(yù)變性35-45195℃10-20secOff模板變性255-65℃10-20secOff退火372℃20-60secOn延伸第78頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3.提高PCR反應(yīng)特異性的策略第79頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月巢式PCR（Nest-PCR）四種策略

遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動(dòng)PCR（HotStartPCR）

使用PCR增強(qiáng)劑第80頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月策略之一巢式PCR（Nested-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。

第81頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterestNestedPCR:toincreasespecificity第82頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月策略之二遞減PCR（TouchDownPCR）

遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。

特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢。

遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。第83頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月策略之三熱啟動(dòng)PCR（HotStartPCR）

熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度；

現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用；

熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。第84頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月策略之四使用PCR增強(qiáng)劑

甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。

其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。

增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)

第85頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月4.PCR常見問題及分析第86頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DenaturationTempAnnealingTempExtensionTempTimeNumberofCyclesReactionVolume“Odd”ProtocolsPCRCyclingParametersWaterBufferDNAtemplatePrimersNucleotidesMg++ionsDNAPolymeraseExtrasReactionComponents第87頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月IMPORTANT!BasicExperimentalDesignAwell-designedexperimentcankeepyoufromevergettingintotrouble!Apoorly-designedexperimentisaskingforproblems!!!!Mainpoint:AlwaysuseCONTROLSPositivecontrolSoyou’llknowwhatasuccessfulresultlookslike.NegativecontrolLetsyouknowifyouhavecontamination.第88頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ExperimentalDesign:ControlsNopositiveornegativecontrols…Whatdoesthisresultmean??Onlyapositivecontrol…Howdoweknowtheresultisn’tduetocontamination?Bothpositiveandnegativecontrols…Resultscanbeinterpretedwithconfidence.UU+U-+第89頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之一無擴(kuò)增產(chǎn)物（假陰性）模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；第90頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第91頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之二

非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。第92頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴(kuò)增第93頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之三

拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12第94頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾第95頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

對策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。第96頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR常見問題之五引物二聚體第97頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月5.分子檢測的靶標(biāo)基因第98頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PurvisandHector,2000,Nature昆蟲菌物昆蟲和菌物的物種豐富度第99頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ThemitochondrialcytochromeoxidasecsubunitI(COI)geneisoneofthemostpopularmarkersforpopulationgeneticandphylogeographicstudiesacrosstheanimalkingdom.第100頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月5`3`LCOF1490*Ag1718F°14012942COItRNACodingRegionsGeneCodingRegionsControlRegionBarcodingRegionForwardPrimerReversePrimerHCOR2198*Ag1859R°mtDNAGenomeTheorderofgenesonthemitochondrialgenome第101頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月RelativelywellstudiedatthebiochemicallevelSizeandstructureconservedacrossallaerobicorganismsMixofvariableandconservedregionsLargestofthethreeCOsubunitsBroadspectrumofsubstitutionalrates第102頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月菌物常用的靶標(biāo)基因第103頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第104頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖體基因包括5S、5.8S、18S、28S在內(nèi)的4個(gè)rDNA基因，是細(xì)胞核內(nèi)染色體上的多拷貝、中度重復(fù)序列。編碼18S、5.8S和28S的rDNA作為1個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，以中等重復(fù)的串聯(lián)形式存在于染色體上。第105頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月18S(SSU)5.8S28S(LSU)IGSITS1ITS2IGS5’3’IGS，基因間隔區(qū)（intergenicregionspacer）；ITS，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribedspacer）ITS5ITS1ITS3ITS2ITS4ITS4-BrDNA（核糖體DNA）基因的結(jié)構(gòu)圖第106頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ITS作為DNA條形碼的優(yōu)點(diǎn)（1）ITS兩側(cè)序列保守便于設(shè)計(jì)通用引物，可廣泛應(yīng)用于PCR擴(kuò)增；（2）ITS的高重復(fù)度有利于從微量DNA樣品中進(jìn)行檢測（3）ITS可應(yīng)用于同屬近緣種及種內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系研究；第107頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月IGS（Intergenicspacer，核糖體基因內(nèi)間隔區(qū)）序列：分開每個(gè)重復(fù)序列的DNA片段。相對于ITS區(qū)，IGS是一個(gè)高變區(qū),它們常用于屬內(nèi)種間比較或種內(nèi)群體比較。第108頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第109頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月betatubulinActinRNApolymeraseIIlargesubunit,RPB1Translationelongationfactor1-αYpt1…….菌物常用的靶標(biāo)基因第110頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ListofprimersreportedfortheidentificationanddetectionofPhytophthoraspeciesknowntothreatenforestsandothernaturalecosystems.第111頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第112頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體DNA是真核生物細(xì)胞核外一種呈環(huán)狀的小分子雙鏈DNA，單拷貝，不含基因間隔區(qū)和內(nèi)含子，進(jìn)化歷史簡單明了，酶切位點(diǎn)少，易于分析。由于mtDNA的分子進(jìn)化速度比細(xì)胞核DNA快，所以mtDNA分子的分析物種種內(nèi)和種間的分類靈敏度高，應(yīng)用PCR等分子生物學(xué)技術(shù)可將分類單位精確到種以下，可以用來對種、變種、個(gè)體菌株及雜交種進(jìn)行檢測。線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA第113頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第114頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第115頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第116頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第117頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第118頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第119頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第120頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第121頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題：1.核酸沉淀常用的有機(jī)溶劑，他們的優(yōu)缺點(diǎn)是什么。2.核酸提取不純的原因是什么，如何改進(jìn)。3.基因組提取過程中降解的原因及改進(jìn)。4.1個(gè)PCR循環(huán)是有哪幾步組成，分別是什么。5.不同PCR的類型，6.多重PCR如何進(jìn)行，有什么優(yōu)缺點(diǎn)7.定量PCR、擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線、絕對定量、相對定量、-ΔΔCt、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

8.SYBRGreen法和TaqMan法9.Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）、陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛、熔解曲線不止一個(gè)主峰的原因。10.TouchDownPCR是什么。11假陰性、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性和引物二聚體出現(xiàn)的原因是什么，如何改進(jìn)。12.COI、ITS、IGS指的是，有什么價(jià)值第122頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第4節(jié)核酸雜交技術(shù)第123頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸雜交技術(shù)核酸雜交（hybridization）是兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈在特定的條件下退火形成異質(zhì)雙鏈的過程。核酸雜交技術(shù)是建立在以堿基互補(bǔ)為基礎(chǔ)的、以雙鏈核酸分子在特定條件下的變性和復(fù)性為手段的，對核酸分子進(jìn)行定性和定量檢測的技術(shù)。第124頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸雜交既可以是DNA與DNA鏈、RNA與RNA鏈之間的雜交，又可以是DNA與RNA鏈之間的雜交。核酸雜交可進(jìn)行染色體圖譜分析，測定特異DNA序列的拷貝數(shù)（甚至可檢測到哺乳動(dòng)物基因組中的單拷貝基因），鑒定與疾病有關(guān)的限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)行基因克隆的篩選，檢測不同濃度的DNA，鑒別特異基因的表達(dá)部位，第125頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針含有標(biāo)記物的與待檢測核酸片段具有高度同源性的特定核酸片段，可以對待檢測核酸進(jìn)行定性、定量和定位的工具。根據(jù)核酸探針分子性質(zhì)的不同可分為DNA探針和RNA探針；根據(jù)核酸探針來源的不同又分為基因組DNA探針、人工合成的寡核苷酸探針和cDNA探針。第126頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月探針的標(biāo)記放射性標(biāo)記物32P、3H、35S、14C、125I、或131I非放射性標(biāo)記物

地高辛(Digoxigenin,Dig)；熒光素(fluorecein)標(biāo)記，如羅丹明或FITC；生物素

；第127頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月SouthernblotNorthernblot斑點(diǎn)雜交

斑點(diǎn)雜交是分子雜交中最簡單的一種，直接