臨床微生物檢驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)班課件 7-王賀-真菌行標(biāo)解讀及經(jīng)驗(yàn)分享

《侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作規(guī)范》解讀和經(jīng)驗(yàn)分享北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科?

起草單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、北京大學(xué)第一醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院?

起草人：徐英春、李若瑜、章強(qiáng)強(qiáng)、王瑤、王賀、余進(jìn)、郭莉娜、張麗、范欣。?

本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有II級(jí)生物安全防護(hù)能力的臨床實(shí)驗(yàn)室。侵襲性真菌病invasive

fungaldisease，IFD?

真菌侵入人體組織、血液，并在其中生長(zhǎng)繁殖所致組織損害、器官功能障礙、炎癥反應(yīng)的病理改變及病理生理過(guò)程。?

根據(jù)患者宿主因素、臨床特征和微生物學(xué)檢查、將IFD診斷分為確診、擬診和疑似。內(nèi)容?

標(biāo)本采集處理?

標(biāo)本形態(tài)檢查?

培養(yǎng)檢查?

真菌培養(yǎng)鑒定?

非培養(yǎng)診斷方法?

藥物敏感試驗(yàn)血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第一步：用皂液和流動(dòng)水/含酒精快速手消進(jìn)行手衛(wèi)生?

第二步：用酒精紗布消毒培養(yǎng)瓶塞，充分待干血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第三步：穿刺部位皮膚消毒?

三步法–

70%乙醇擦拭靜脈穿刺部位，作用30s以上、待干；–

1%-2%碘酊從穿刺點(diǎn)向外畫(huà)圈消毒至消毒區(qū)域直徑>3cm，作用30

s或10

%碘伏作用60

s；–

70

%乙醇脫碘：對(duì)碘過(guò)敏者，用70%乙醇消毒60s，待乙醇揮發(fā)干燥、采集標(biāo)本?

一步法–

葡萄糖酸氯己啶作用30s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個(gè)月以內(nèi)的新生兒。血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第四步：戴手套?

如需對(duì)穿刺部位進(jìn)行觸診，戴無(wú)菌手套?

如無(wú)需對(duì)穿刺部位進(jìn)行觸診，戴非無(wú)菌手套血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第五步：抽血?

至少采集2套。?

標(biāo)本與培養(yǎng)基比例為1/10~1/5（成人每瓶8ml~10ml）?

應(yīng)包括需氧瓶或真菌瓶血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第五步：抽血?

宜在抗真菌藥物使用前，發(fā)熱初期或寒顫期采靜脈血或骨髓液?

至少采集2套?

標(biāo)本與培養(yǎng)基比例為1/10~1/5（成人每瓶8ml~10ml）?

應(yīng)包括需氧瓶或真菌瓶血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第六步：混勻?

血標(biāo)本接種到培養(yǎng)瓶后，輕輕顛倒混勻以防血液凝固（不要大力搖晃）?

抽取導(dǎo)管血和外周血以診斷導(dǎo)管相關(guān)性血流感染，標(biāo)記抽血部位和抽血時(shí)間尤為重要血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程?

第七步：從另一部位穿刺采集第二套血培養(yǎng)，方法同前血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采集流程第八步：送檢?

2h內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存?

不得冷藏或冷凍標(biāo)本采集處理-血液?

評(píng)估導(dǎo)管相關(guān)性血流感染（CRBSI）–

如患者已拔管，應(yīng)采集2套外周血進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)做導(dǎo)管尖Maki法半定量培養(yǎng)（導(dǎo)管尖長(zhǎng)5cm），如1套及以上外周血培養(yǎng)陽(yáng)性，導(dǎo)管尖培養(yǎng)陽(yáng)性（≥15

CFU），且血培養(yǎng)與導(dǎo)管尖培養(yǎng)菌種相同，即為CRBSI標(biāo)本采集處理-血液?

評(píng)估導(dǎo)管相關(guān)性血流感染（CRBSI）–

如患者尚未拔管，應(yīng)至少采集1套外周血培養(yǎng)，同時(shí)盡快采集等量的導(dǎo)管血進(jìn)行培養(yǎng)，?

如導(dǎo)管血與外周血培養(yǎng)均陽(yáng)性，導(dǎo)管血陽(yáng)性時(shí)間比外周血早2h，或?qū)Ч苎芯繛橥庵苎芯?倍以上，且沒(méi)有其它明確感染源，即為CRBSI；?

如導(dǎo)管血培養(yǎng)陰性，外周血培養(yǎng)陽(yáng)性且為念珠菌屬，且沒(méi)有其它明確感染源，也可能為CRBSI。標(biāo)本采集處理-骨髓?

骨髓

：–

肝素化的注射器或溶解離心管–

0.5ml（兒童）至3ml（成人）一次性骨穿包骨穿操作采集足量骨髓液送檢標(biāo)本采集處理-骨髓?

骨髓

：–

15分鐘內(nèi)常溫送檢，若不能及時(shí)送檢，則常溫保存–

需培養(yǎng)可接種于培養(yǎng)瓶，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性–

同時(shí)做吉姆薩染色鏡檢骨髓革蘭染色卵圓形孢子瑞氏吉姆薩染色孢子位于巨噬細(xì)胞內(nèi)標(biāo)本采集處理-靜脈導(dǎo)管?

靜脈導(dǎo)管–

導(dǎo)管尖段5cm–

15分鐘內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，4?C保存–

尖Maki法半定量培養(yǎng)：使用無(wú)菌鑷子將其從平板一端滾動(dòng)至另一端，滾動(dòng)4次–

不應(yīng)使用含放線菌酮的培養(yǎng)基標(biāo)本采集處理-無(wú)菌體液?

無(wú)菌體液（腦脊液，心包液，腹水和關(guān)節(jié)液）–

腦脊液：脊髓穿刺針采取–

其它：含肝素的無(wú)菌真空采血管–

15min內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存（不能冷藏）–

大于2ml：2000g離心10分鐘，取沉渣接種–

少于2ml：則將標(biāo)本直接接種于培養(yǎng)基–

涂片鏡檢：宜使用細(xì)胞離心機(jī)–

腦脊液可直接接種于血培養(yǎng)瓶標(biāo)本采集處理?

膿液、引流液、創(chuàng)面分泌物及竇道–

開(kāi)放性創(chuàng)口：用無(wú)菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，應(yīng)采集病灶活動(dòng)性邊緣組織標(biāo)本–

封閉性膿腫：局部皮膚消毒后，用注射器抽取膿血性液體送檢–

2h內(nèi)常溫送檢–

直接接種于培養(yǎng)基，較濃稠的標(biāo)本應(yīng)使用消化液處理標(biāo)本采集處理-下呼吸道標(biāo)本?

下呼吸道標(biāo)本（深部痰液、支氣管吸取物、肺泡灌洗液）–

痰液：清潔口腔后采集清晨第一口痰液–

支氣管毛刷取樣和采集肺泡灌洗液–

唾液或24h痰液都不能用于真菌培養(yǎng)–

2h內(nèi)室溫送檢；若不能及時(shí)送檢，則4°C保存–

含抗生素的選擇培養(yǎng)基–

較黏稠的下呼吸道標(biāo)本：消化液處理，2000g離心10分鐘后，取沉渣接種標(biāo)本采集處理-眼?

眼（角膜刮片、玻璃體液等）–

角膜刮片或針吸玻璃體液–

15min內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存–

角膜刮取標(biāo)本：不含抑制劑的培養(yǎng)皿，

X或C型涂菌方式–

玻璃體液：離心后取沉淀物接種標(biāo)本采集處理-組織?

組織–

無(wú)菌容器轉(zhuǎn)運(yùn)，如標(biāo)本量少，滴加幾滴無(wú)菌鹽水保濕–

及時(shí)送檢，否則應(yīng)室溫保存–

滅菌眼科剪，將組織標(biāo)本剪成米粒大小后接種培養(yǎng)–

可疑組織胞漿菌感染：研磨組織，或采用裂解離心技術(shù)處理–

可疑接合菌感染：直接接種不研磨組織–

含抗生素培養(yǎng)基和血培養(yǎng)基–

直接鏡檢：研磨組織–

病理科與檢驗(yàn)科聯(lián)合檢查組織標(biāo)本標(biāo)本采集處理-尿液?

尿液–

早晨第一次清潔尿液–

恥骨上聯(lián)合穿刺尿液–

導(dǎo)管尿液–

10ml~50ml–

2h內(nèi)常溫送檢；若不能及時(shí)送檢，則4°C保存–

2000g離心10分鐘，取沉渣進(jìn)行鏡檢和接種標(biāo)本形態(tài)檢查?

10%氫氧化鉀、墨汁、無(wú)菌生理鹽水?

酵母樣孢子：酵母菌?

酵母樣孢子和假菌絲：念珠菌屬?

有莢膜的酵母樣孢子：隱球菌標(biāo)本形態(tài)檢查?

透明、有隔菌絲，呈45?分支鹿角樣：提示曲霉屬?

透明、無(wú)隔或少隔菌絲，菌絲寬大，呈90分支：提示接合菌綱真菌；?

棕色或黑色菌絲或孢子：提示暗色絲狀真菌痰涂片15R02466念珠菌27痰，曲霉28痰，煙曲霉29痰，曲霉，低倍鏡30痰，墨汁染色15R0510731痰，KOH壓片32六胺銀

曲霉33毛霉

病理

六胺銀34毛霉35隱球菌，腦脊液，革蘭染色15W0398836隱球菌，腦脊液，墨汁染色15W0398837治療兩周后38痰，墨汁染色

15R0490539痰，弱抗酸染色

15Z0951640痰，弱抗酸染色，低倍41六胺銀染色，隱球菌42培養(yǎng)檢查?

培養(yǎng)基–

沙保弱葡萄糖瓊脂、馬鈴薯瓊脂、腦心浸膏瓊脂等，顯色培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中可加入氯霉素或慶大霉素?

操作步驟–

螺口管斜面培養(yǎng)法：接種于斜面中下部，封口，建議平行接種兩管–

平板培養(yǎng)：三區(qū)劃線接種培養(yǎng)條件?

通常28±1?C培養(yǎng)7天?

雙相真菌：同時(shí)在28±1

?C及35±1?C?

組織、腦脊液等標(biāo)本，或懷疑罕見(jiàn)真菌或慢生長(zhǎng)真菌（如莢膜組織胞漿菌、隱球菌）感染時(shí)，建議至少培養(yǎng)1個(gè)月。真菌培養(yǎng)鑒定真菌培養(yǎng)單一真菌生長(zhǎng)判斷有無(wú)意義一種以上真菌生長(zhǎng)判斷致病菌及污染菌致病真菌分純污染菌污染菌致病真菌酵母樣菌落絲狀真菌顯色培養(yǎng)基或生化方法質(zhì)譜鑒定或基因測(cè)序確定種屬顯微鏡檢或小培養(yǎng)觀察形態(tài)判斷有無(wú)臨床意義：?

在嚴(yán)格防止污染條件下，組織標(biāo)本及無(wú)菌體液標(biāo)本中有任何真菌生長(zhǎng)都有意義。?

非無(wú)菌標(biāo)本，視情況而定–

兩個(gè)試管有同一形態(tài)真菌生長(zhǎng)，真菌鏡檢同時(shí)陽(yáng)性者提示可能有臨床意義；–

僅一管生長(zhǎng)，生長(zhǎng)部位為非接種部位，菌落為霉菌樣則可能是污染。?

結(jié)合標(biāo)本直接鏡檢結(jié)果和患者臨床癥狀體征、影像學(xué)及其它檢查結(jié)果綜合分析真菌培養(yǎng)鑒定?

形態(tài)學(xué)鑒定–

觀察菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)–

絲狀真菌鏡下形態(tài)觀察：透明膠帶法，利用膠帶先粘一定量菌絲，再粘在預(yù)先滴加乳酸酚棉藍(lán)的載玻片上，顯微鏡下觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、大小和排列等–

酵母菌鏡下觀察采用生理鹽水涂片法絲狀真菌鑒定重要步驟—乳酸酚棉蘭壓片1.在玻片滴上棉蘭2.制作膠帶粘菌小旗3.

膠帶黏面輕壓菌苔粘菌4.在膠帶與棉棒交接處滴數(shù)滴75%酒精5.翻轉(zhuǎn)棉棒有菌面貼在撥片51絲狀真菌鑒定重要步驟—乳酸酚棉蘭壓片6.膠膜上再滴棉蘭7.再加上蓋玻片8.用手壓實(shí)蓋玻片52黃曲霉黑曲霉構(gòu)巢曲霉土曲霉土曲霉根霉（Rhizopus）?

臨床上大部分毛霉病由根霉引起?

寬大飄帶樣菌絲，很少分隔，孢子囊球形，孢囊柄不分枝，末端對(duì)生有發(fā)達(dá)的假根，有囊軸和囊托，囊托圓形58根霉（Rhizopus）?

眼窩吸取物，65y

F，糖尿病592011

F-15?

根霉（Rhizopus）60毛霉（Mucor）?

羊毛狀菌絲體，球形孢子囊?

沒(méi)有假根，沒(méi)有囊托，孢囊梗很少分枝，不能在37

?C以上生長(zhǎng)?

根霉在37

?C生長(zhǎng)良好61毛霉（Mucor）?

Balf，34y

M，免疫抑制，肺損傷62毛霉（Mucor）犁頭霉（Myocladus

sp.）?

人類(lèi)感染常見(jiàn)于嚴(yán)重免疫受損者，如化療、糖尿病、骨髓移植患者，可引起肺、皮膚、鼻腦和播散性感染。?

菌落為透明，羊毛狀菌絲體，纖維樣，生長(zhǎng)迅速?

菌絲寬大，遠(yuǎn)隔飄帶樣，直角分枝，孢囊柄分枝，末端產(chǎn)生孢子囊，內(nèi)有孢囊孢子，有囊軸，孢子囊與囊軸構(gòu)成梨形，囊軸脫落后囊托呈酒杯狀，有假根側(cè)生。最佳生長(zhǎng)溫度37

?C，45-52

?C可生長(zhǎng)犁頭霉（Myocladus

sp.）?

鼻竇吸取物，34y骨髓移植患者652011

F-1466總狀共頭霉（Syncephalastrumsp.）?

共頭霉屬，腐生菌，可分離自土壤和環(huán)境，熱帶或亞熱帶?

總狀共頭霉是該屬中的唯一菌種，接合菌綱?

菌落落生長(zhǎng)快速，棉花或絨毛狀，白至淺灰色，產(chǎn)生孢子囊后變?yōu)樯罨疑?

寬大透明菌絲，隔罕見(jiàn)?

孢子囊柄直立，合軸分枝（總狀分枝），有假根，末端形成球形或卵形的囊，整個(gè)表面布滿柱狀孢子囊，成熟的孢子囊薄壁，有5-10個(gè)球形至卵形的柱囊孢子，孢子壁光滑?

最佳生長(zhǎng)溫度20~40oC67總狀共頭霉（Syncephalastrumsp.）?

標(biāo)本：支氣管灌洗液，64歲，男性，慢性阻塞性肺疾病68總狀共頭霉（Syncephalastrumsp.）69真菌培養(yǎng)鑒定?

芽管形成試驗(yàn)-白念珠菌鑒定–

將念珠菌接種于0.2ml~0.5ml人或動(dòng)物血清中，37°C孵育1.5h~4h，鏡檢觀察有無(wú)芽管形成。–

需設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，注意熱帶念珠菌在血清中孵育6h或更久也可形成芽管真菌培養(yǎng)鑒定?

小培養(yǎng)形態(tài)學(xué)鑒定–

將刀片消毒，在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上切一小塊約0.5cm2的瓊脂塊，放在滅菌載玻片上；–

用接種針挑取待測(cè)菌株的少量菌絲（肉眼可見(jiàn)即可），分別接種在瓊脂塊的四角位置；–

將滅菌后的蓋玻片置于瓊脂塊表面；–

在無(wú)菌平皿中放入無(wú)菌的玻璃棒（或其它支持物），加適量無(wú)菌水或含水棉球、紗布，將載玻片放入無(wú)菌平皿的支持物上，蓋上蓋玻片；–

28±1oC培養(yǎng)，每天觀察至產(chǎn)孢良好或菌絲豐富時(shí)，提起蓋玻片，移去瓊脂塊，分別將蓋玻片和載玻片制片，顯微鏡觀察真菌培養(yǎng)鑒定?

顯色培養(yǎng)基鑒定–

30~37

?C培養(yǎng)48h–

對(duì)于顯色不典型及臨床少見(jiàn)念珠菌鑒定不準(zhǔn)確–

綠色：白念珠菌；–

藍(lán)灰色或者鐵藍(lán)色：熱帶念珠菌；–

粉紅色，邊緣模糊有微毛刺：克柔念珠菌；–

中央為紫色：光滑念珠菌；–

白色：其它念珠菌真菌培養(yǎng)鑒定?

生化方法鑒定?

菌種鑒定正確（Agree）：常規(guī)與復(fù)核一致?

非顯著錯(cuò)誤（Minor

Errors）：1)

正確鑒定到屬但未鑒定到種2)

正確鑒定到菌種復(fù)合體近平滑念珠菌復(fù)合體光滑念珠菌復(fù)合體?

顯著錯(cuò)誤（Major

Errors）：菌種鑒定錯(cuò)誤CHIF-NET2010-2014白念珠菌總數(shù)一致顯著錯(cuò)誤非顯著錯(cuò)誤39651526151594164511697.7%84.3%85.6%85.1%93.2%32.8%85.9%2.1%14.0%13.9%14.3%5.9%0.2%1.7%0.5%5%0.9%14.7%2.7%近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌新型隱球菌其他酵母菌總計(jì)52.6%11.4%9673真菌培養(yǎng)鑒定?

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）鑒定–

蛋白質(zhì)譜圖，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的真菌參考譜圖比對(duì)真菌培養(yǎng)鑒定?

基于核酸分子生物學(xué)鑒定–

真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS區(qū)）、28SrDNA、延長(zhǎng)因子，?微管蛋白，鈣調(diào)蛋白等–

所得序列需要與兩個(gè)或兩個(gè)以上真菌基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到可靠鑒定結(jié)果結(jié)果解釋?

培養(yǎng)陽(yáng)性–

無(wú)菌部位標(biāo)本：報(bào)告實(shí)際培養(yǎng)結(jié)果–

非無(wú)菌部位標(biāo)本：應(yīng)結(jié)合標(biāo)本直接鏡檢結(jié)果和患者臨床癥狀體征、影像學(xué)及其它檢查結(jié)果綜合分析，并以此為依據(jù)判斷是否需要對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)?

培養(yǎng)陰性–

初步報(bào)告：培養(yǎng)7天無(wú)真菌生長(zhǎng)，可發(fā)初步陰性報(bào)告“培養(yǎng)7天無(wú)真菌生長(zhǎng)”–

終報(bào)告：初步陰性報(bào)告后，每周觀察，根據(jù)最終培養(yǎng)時(shí)間發(fā)終報(bào)告“培養(yǎng)XX周無(wú)真菌生長(zhǎng)”。IFD實(shí)驗(yàn)室非培養(yǎng)技術(shù)（1-3）-β

-D葡聚糖真菌篩查曲霉菌屬隱球菌屬曲霉半乳甘露聚糖隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室非培養(yǎng)技術(shù)血清學(xué)診斷念珠菌甘露聚糖念珠菌屬曲霉、念珠IgG抗體鑒別IFD的感染階段及感染類(lèi)型抗體檢測(cè)曲霉、念珠IgM抗體分子生物學(xué)診斷非培養(yǎng)診斷方法-G試驗(yàn)?

1,3-β-D-葡聚糖檢測(cè)（G

試驗(yàn)）–

可檢測(cè)除隱球菌、接合菌之外，臨床絕大多數(shù)的侵襲性真菌感染，包括念珠菌、曲霉、肺孢子菌等。–

假陽(yáng)性因素：血液透析、腹膜透析、乳糜血、棉花制品、免疫球蛋白、蘑菇多糖、膽固醇過(guò)高或內(nèi)毒素等–

每周檢測(cè)兩次或依病情而定mannoproteinsb1,3b1,6glucansPPLbilayerb1,3

glucansynthasechitinergosterol非培養(yǎng)診斷方法-GM試驗(yàn)?

半乳甘露聚糖檢測(cè)

(GM

試驗(yàn))–

曲霉特異性細(xì)胞壁成分，由菌絲在組織中生長(zhǎng)時(shí)釋放出來(lái)–

利用雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法，與半乳甘露聚糖的1,

5-β-D-呋喃半乳糖苷側(cè)鏈結(jié)合，檢測(cè)標(biāo)本中半乳甘露聚糖含量–

假陽(yáng)性常見(jiàn)原因：青霉、隱球菌感染；消化道定植或食物中的曲霉污染；大劑量使用激素、透析等–

推薦每周兩次或依病情而定。GM試劑盒?

Pastorex

Aspergillus

(LA):檢測(cè)限15ng/ml?

Platelia

Aspergillus

(ELISA):

0.5-1.0

ng/ml–

更敏感15~20倍–

比LA更早陽(yáng)性（2-3周）標(biāo)本OD＝平均質(zhì)控OD–

LA陰性時(shí)仍可能陽(yáng)性

cut-off

0.5GM試劑盒?

丹娜生物：競(jìng)爭(zhēng)法ELISA標(biāo)本中的抗原和酶標(biāo)板上包被的固相抗原均與試劑中半乳甘露聚糖抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，與試劑中半乳甘露聚糖抗體結(jié)合越多，剩余的抗體與包被抗原結(jié)合的越少，抗原抗體結(jié)合物與酶標(biāo)抗體結(jié)合的越少，最后的顯色也愈淺。非培養(yǎng)診斷方法?

隱球菌抗原檢測(cè)–

利用乳膠凝集法、

酶聯(lián)免疫吸附、側(cè)向?qū)游龅权C

乳膠凝集法，血清中含有類(lèi)風(fēng)濕因子、標(biāo)本中含瓊脂凝固劑、二氧化碳嗜纖維菌感染、白吉利毛孢子菌感染、羥乙基淀粉、血清中含＞200mg的Fe3+/dL、HIV感染者非特異性反應(yīng)、反應(yīng)玻片的不正確清洗等可導(dǎo)致假陽(yáng)性；感染早期、莢膜抗原濃度低、血清中含有免疫復(fù)合物、莢膜抗原濃度高引起的前帶效應(yīng)、抗原分泌量少等可導(dǎo)致假陰性。–

ELISA法，其他微生物感染如毛孢子菌屬感染可導(dǎo)致假陽(yáng)性；感染早期、莢膜抗原濃度低、血清中含免疫復(fù)合物、抗原分泌量少等可導(dǎo)致假陰性–

血清或腦脊液滴度≤1:4的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，高度懷疑隱球菌感染；滴度≥1:8

則認(rèn)為患有隱球菌病。非培養(yǎng)診斷方法?

基于分子生物學(xué)的非培養(yǎng)檢測(cè)–

在有資質(zhì)的臨床微生物分子診斷實(shí)驗(yàn)室，可利用標(biāo)本直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)病原真菌。其臨床報(bào)告應(yīng)遵從國(guó)內(nèi)分子檢測(cè)相關(guān)規(guī)程，并進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。藥物敏感試驗(yàn)?

微量肉湯稀釋法–

培養(yǎng)基：RPMI1640,0.165mol/L

MOPS,

pH7.0±0.1–

適用菌種：酵母菌、絲狀真菌–

檢測(cè)藥物：氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈、米卡芬凈。微量肉湯稀釋法–

酵母菌結(jié)果判讀：?

兩性霉素B讀取100%抑制MIC值；?

氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶、卡泊芬凈、米卡芬凈讀取50%抑制的MIC值–

絲狀真菌結(jié)果判讀：?

兩性霉素B讀取菌株生長(zhǎng)100%抑制的MIC值；?

氟胞嘧啶，50%抑制；?

伊曲康唑、伏立康唑，80%抑制；?

曲霉對(duì)棘白菌素類(lèi)藥敏試驗(yàn)讀MEC值–

折點(diǎn)：CLSIM27-S4SS-DDa（μg/ml）IbR抗菌藥物氟康唑c菌種（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）﹣≥8≥64﹣≥8≥8≥1﹣≥2≥1≥1≥1≥0.5≥1≥1≥8≥8≥1白念珠菌≤2﹣4光滑念珠菌克柔念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌白念珠菌≤32﹣﹣﹣﹣﹣﹣﹣≤24≤24≤0.12﹣0.25~0.5光滑念珠菌克柔念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌白念珠菌﹣﹣﹣﹣﹣伏立康唑d,e≤0.5≤0.12≤0.12≤0.25≤0.12≤0.25≤0.25≤210.25~0.50.25~0.5﹣0.50.250.50.54光滑念珠菌熱帶念珠菌克柔念珠菌近平滑念珠菌季也蒙念珠菌白念珠菌﹣﹣卡泊芬凈d,f﹣﹣≤2﹣4≤0.25﹣0.5光滑念珠菌g熱帶念珠菌克柔念珠菌近平滑念珠菌季也蒙念珠菌≤0.06≤0.25≤0.25≤2﹣﹣﹣﹣﹣0.120.50.54≥0.25≥1米卡芬凈d≥1≥8≤24≥8微量肉湯稀釋法?

a

S-DD：敏感性取決于最大的血液藥物濃度水平。對(duì)氟康唑，腎功能和基礎(chǔ)情況正常的成人需要給予超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)劑量（6mg?kg/天）或更高劑量治療。?

b

中介定義為菌株的敏感性不確定，不能明確的判定為敏感或耐藥。?

c

對(duì)氟康唑，折點(diǎn)的制定是根據(jù)大量的粘膜及侵襲性念珠菌感染者制定的。對(duì)光滑念珠菌，MIC≤32時(shí)應(yīng)該給予最大劑量的氟康唑治療。?

d

數(shù)據(jù)主要來(lái)源于非中性粒細(xì)胞缺乏的念珠菌血癥患者。?

e

目前的數(shù)據(jù)還不足以說(shuō)明光滑念珠菌對(duì)伏立康唑體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效、預(yù)后的關(guān)系。?

f

卡泊芬凈敏感性試驗(yàn)結(jié)果會(huì)因不同的試驗(yàn)方法而有較大可變性。?

g

光滑念珠菌對(duì)米卡芬凈的MICs相比較其他棘白菌素類(lèi)藥物稍低，但并不意味著米卡芬凈對(duì)光滑念珠菌的活性更強(qiáng)。微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株及質(zhì)控范圍多變擬青霉ATCCMYA-3630（μg/ml）近平滑念珠菌ATCC22019（μg/ml）0.5~4克柔念珠菌ATCC6258（μg/ml）抗菌藥物兩性霉素B氟康唑1~41~41~416~1280.25~10.25~10.12~0.58.0~32﹣伊曲康唑卡泊芬凈米卡芬凈氟胞嘧啶0.06~0.50.12~0.50.5~4﹣﹣﹣0.5~40.12~0.5藥物敏感試驗(yàn)?

改良微量肉湯稀釋法–

原理：在半固體培養(yǎng)基中檢測(cè)抗真菌藥物敏感性，與生長(zhǎng)對(duì)照比，通過(guò)生長(zhǎng)濁度判定MIC值–

適用菌種：念珠菌屬、新型隱球菌–

檢測(cè)藥物：氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、兩性霉素B–

注意：唑類(lèi)藥物存在“拖尾”現(xiàn)象，易將藥敏結(jié)果判讀為假耐藥MIC

1MIC

0.125MIC

0.0616

3264

12812412481248

0.125

0.25

0.5

0.06

0.125

0.25

0.5Control藥物敏感試驗(yàn)?

濃度梯度稀釋法–

培養(yǎng)基：RPMI

1640+MOPS+2%葡萄糖+1.5%瓊脂酵母菌Etest藥敏試驗(yàn)方法培養(yǎng)基RPMI1640+2%葡萄糖+MOPS+1.5%

Bacto瓊脂，pH

7.2~7.4接種量念珠菌：0.5

McFarland新型隱球菌：1

McFarland孵育條件念珠菌：35℃，24~48h（光滑念珠菌和熱帶念珠菌需在48h再次確認(rèn)）新生隱球菌：35℃，48~72兩性霉素B：100%抑制氟胞嘧啶：90%抑制唑類(lèi)：80%抑制判讀方法卡泊芬凈：80%抑制97絲狀真菌Etest方法培養(yǎng)基

RPMI1640+2%葡萄糖+MOPS接種量

曲霉：0.5McFarland鐮刀菌和根霉：1

McFarland孵育條件

曲霉：35℃，16~24h鐮刀菌：35℃24~48h，然后再室溫孵育24~48h根霉：16~24h其它：延長(zhǎng)孵育，每天觀察至出現(xiàn)抑菌圈判讀方法

兩性霉素B：100%抑制唑類(lèi)：80%抑制98藥物敏感試驗(yàn)?

紙片擴(kuò)散法–

培養(yǎng)基：改良Shadomy培養(yǎng)基–

適用菌種：酵母菌–

檢測(cè)藥物：氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、酮康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈（均為9mm藥敏紙片）–

判讀標(biāo)準(zhǔn)：?

兩性霉素B：生長(zhǎng)完全抑制的最小藥物濃度；?

三唑類(lèi)、咪唑類(lèi)、卡泊芬凈：量取至有正常大小菌落生長(zhǎng)的抑菌環(huán)直徑的大小–

注意：不能隨意更改培養(yǎng)基、紙片大小、含量等，否則將導(dǎo)致假耐藥Rosco紙片擴(kuò)散法折點(diǎn)含量SS-DD（mm）21~1516~1422~14﹣I（mm）﹣R（mm）≤14抗菌藥物氟康唑（μg）

（mm）251815101≥22≥17≥

23≥

30≥15≥20≥11伏立康唑伊曲康唑酮康唑﹣≤13≤13≤22≤9≤11≤10﹣29~2314~1019~12﹣兩性霉素B氟胞嘧啶卡泊芬凈﹣﹣5﹣%S-DD：劑量依賴敏感；S：敏感；I：中介；R：耐藥Rosco紙片擴(kuò)散法質(zhì)控株及質(zhì)控范圍白念珠菌ATCC

64548（mm）36~42近平滑念珠菌ATCC

22019（mm）克柔念珠菌ATCC

6258（mm）10~16抗菌藥物氟康唑30~36伏立康唑伊曲康唑酮康唑31~4225~3136~4418~2334~4015~2228~3728~3541~4920~2635~4313~2316~2516~2220~2617~239兩性霉素B氟胞嘧啶卡泊芬凈15~22參考文獻(xiàn)????????[1]

秦啟賢主編：臨床真菌學(xué).

復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.[2]

王端禮主編：醫(yī)學(xué)真菌學(xué)－實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范.

人民衛(wèi)生出版社，2005.[3]

吳紹熙主編：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)手冊(cè)（第二版）.

中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2005.[4]

周庭銀，倪語(yǔ)星。臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作.

上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009.[5]

周庭銀.

臨床微生物學(xué)診斷與圖解（第三版）.

上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012.[6]

JamesV.

Manual

of

Clinical

Microbiology

[M],

10th

ed.Wash