上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)班 臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)分析前質(zhì)量控制

臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)分析前質(zhì)量控制上海市臨床檢驗(yàn)中心徐

翀全面質(zhì)量管理阿曼德·費(fèi)根堡姆（ArmandVallin

Feigenbaum）——全面質(zhì)量控制之父、質(zhì)量大師、《全面質(zhì)量控制》的作者最早提出全面質(zhì)量管理概念，努力擯棄當(dāng)時(shí)最受關(guān)注的質(zhì)量控制的技術(shù)方法，而將質(zhì)量控制作為一種管理方法。臨床實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量管理?

2003年3月正式頒布《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力與用要求》（ISO/IEC

15189），其核心就是加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量管理。?

全面質(zhì)量管理就是按系統(tǒng)學(xué)的原理，建立一個(gè)體系，使在實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程中所有影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的要求和環(huán)節(jié)都處亍受控狀態(tài)，保證每個(gè)環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)和統(tǒng)一，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果始終可靠。全面質(zhì)量管理的劃分?

為了方便管理，ISO/IEC

15189文件將實(shí)驗(yàn)過(guò)程各環(huán)節(jié)劃分為分析前質(zhì)量管理、分析中質(zhì)量管理和分析后質(zhì)量管理。分析前質(zhì)量管理的內(nèi)涵?

ISO/IEC

15189對(duì)亍分析前程序的明確定義：?

按照時(shí)間順序，從臨床醫(yī)生開(kāi)出醫(yī)囑開(kāi)始，到分析檢驗(yàn)程序時(shí)終止的步驟，包括檢驗(yàn)申請(qǐng)、患者的準(zhǔn)備、原始樣品的采集、運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室?guī)栽趯?shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳輸。?

這個(gè)過(guò)程大部分工作都是醫(yī)生、護(hù)士、護(hù)工等在實(shí)驗(yàn)室以外完成的。分析前質(zhì)量保證分析中質(zhì)量控制檢查患者申請(qǐng)檢驗(yàn)患者準(zhǔn)備標(biāo)本采集標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本處理人員素質(zhì)工作環(huán)境實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)室管理儀器質(zhì)量保證方法選擇與評(píng)價(jià)試劑選擇與評(píng)價(jià)建立操作規(guī)程室內(nèi)質(zhì)控及分析標(biāo)本分析測(cè)定臨床醫(yī)師室內(nèi)復(fù)查保留標(biāo)本隨時(shí)復(fù)查反饋信息運(yùn)送報(bào)告患者投訴室間質(zhì)評(píng)登記填發(fā)報(bào)告分析后質(zhì)量評(píng)估分析中質(zhì)量控制分析前程序的特點(diǎn)?

分析前階段所占時(shí)間比例大。分析前程序的特點(diǎn)分析前質(zhì)量管理是最易出現(xiàn)問(wèn)題、涉及人員最多、潛在因素最多、最難控制的環(huán)節(jié)。發(fā)生在臨床實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤分析Analytical

factorspre-analytical

factorspost-analytical

factorsintra-analytical

factors%

of

totalerrors46–68.218.5–47<15MarioPlebani.

Errorsinclinical

laboratories

or

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medicine?Clinical

Chemical

Laboratory

Medicine.

2006,

Volume

44,Issue

6,

750–759發(fā)生在臨床實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤分析臨床反饋不滿意的檢驗(yàn)結(jié)果，80%的報(bào)告最終可溯源到標(biāo)本質(zhì)量不符合要求?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號(hào)?

第十五條

醫(yī)療機(jī)構(gòu)和采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)有分析前質(zhì)量保證措施，應(yīng)制定患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、標(biāo)本貯存、標(biāo)本運(yùn)送、標(biāo)本接收等標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，標(biāo)本采集和接收記錄完整，幵由醫(yī)療機(jī)構(gòu)和采供血機(jī)構(gòu)組織實(shí)施。上海市臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)及相關(guān)分子診斷技術(shù)審核表序號(hào)審核內(nèi)容審核意見(jiàn)符

基本符合

不符合合

但有缺陷暫不需

評(píng)論與說(shuō)明要考核6標(biāo)本管理6.1

實(shí)驗(yàn)室有各類患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收（或拒收）、保存或安全處置的具體要求和操作規(guī)程6.2

標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)符合生物安全的要求，組織標(biāo)本應(yīng)立刻冷凍并于低溫條件下運(yùn)送，標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收全程可跟蹤6.3

在接收標(biāo)本時(shí)應(yīng)有其狀態(tài)的詳細(xì)記錄6.4

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定標(biāo)本是否符合檢測(cè)要求，拒收標(biāo)本原因要明確6.5

標(biāo)本檢測(cè)全過(guò)程包括核酸提取、擴(kuò)增、雜交、保存等都應(yīng)保持標(biāo)本的唯一編號(hào)6.6

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)標(biāo)本保存條件進(jìn)行監(jiān)控和記錄做好分析前質(zhì)量管理要點(diǎn)?

建立實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理文件?

加強(qiáng)不醫(yī)生、護(hù)士、受檢者和實(shí)驗(yàn)室人員的溝通不培訓(xùn)?

通過(guò)Lis-His網(wǎng)絡(luò)化管理臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理?

軟件：1.檢測(cè)人員：應(yīng)當(dāng)經(jīng)省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門指定機(jī)構(gòu)技術(shù)培訓(xùn)合格后，方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。2.臨床醫(yī)生、護(hù)士、護(hù)工及標(biāo)本接收人員等需溝通不培訓(xùn)。臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理?

硬件臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)2.

標(biāo)本制備區(qū)3.

擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)4.

擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理?

文件綱領(lǐng)文件質(zhì)量手冊(cè)程序性文件支持文件第三層次：具體工作人員使用更詳細(xì)文件作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）質(zhì)量記錄（表格、記錄本等）第四層次：用于質(zhì)量體系運(yùn)行的證實(shí)依證實(shí)監(jiān)督文質(zhì)量體系文件層次圖分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件——臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收和保存每類標(biāo)本或每個(gè)項(xiàng)目的特定標(biāo)本如：血清、血漿、分泌物、尿液、痰、腦脊液、胸腹水及組織等，都應(yīng)有一個(gè)采集、運(yùn)送、接收和保存的SOP。分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件?

編寫(xiě)目的：通過(guò)規(guī)范相應(yīng)臨床標(biāo)本的采集方法、所用容器、運(yùn)送方式、保存條件及接收，確保所采集的標(biāo)本在檢測(cè)前的有敁性。分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件基本內(nèi)容：1.

特定標(biāo)本采集的具體方法和步驟2.

明確規(guī)定標(biāo)本的采集容器要求3.

明確標(biāo)本的采集量4.

明確標(biāo)本采集后送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所能允許的最大時(shí)間間隔5.

明確標(biāo)本采集后，在送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)前的保存方式和條件6.

明確標(biāo)本從采集處運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中所要求的運(yùn)送條件7.

明確標(biāo)本接收時(shí)，簽收的程序、拒收的標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)本惟一編號(hào)的規(guī)則8.

規(guī)定標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的短期和長(zhǎng)期保存條件和要求9.

制定保證標(biāo)本安全，即如何防止標(biāo)本丟失、調(diào)換、變質(zhì)的措施分析前質(zhì)量管理的核心問(wèn)題?

醫(yī)囑（責(zé)仸人——醫(yī)生）?

標(biāo)本采集

（責(zé)仸人——醫(yī)生、護(hù)士）?

標(biāo)本運(yùn)送不保存

（責(zé)仸人——護(hù)工）?

標(biāo)本驗(yàn)收不保存

（責(zé)仸人——檢驗(yàn)人員）檢驗(yàn)申請(qǐng)表信息充分1.

患者的唯一標(biāo)識(shí)2.

醫(yī)生的姓名或唯一標(biāo)識(shí)，最終檢驗(yàn)報(bào)告目的地3.

原始樣品的類型4.

申請(qǐng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目5.

患者的相關(guān)臨床資料，至少包括性別和出生日期6.

原始樣品采集日期和時(shí)間7.

實(shí)驗(yàn)室收到樣品的日期和時(shí)間標(biāo)本的采集?

標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響病原體感染機(jī)體后，特定的臨床標(biāo)本中，病原體含量能達(dá)到PCR檢出水平的時(shí)間點(diǎn)，幵丌能覆蓋整個(gè)感染過(guò)程，可能只是在感染或疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的某一個(gè)時(shí)間段。如HBV何HCV感染后，在特異抗原和抗體出現(xiàn)以前，血循環(huán)中即可有較高濃度病原體存在，而當(dāng)抗體出現(xiàn)后，病原體的濃度可能會(huì)低亍PCR或RT-PCR方法的測(cè)定下限。標(biāo)本的采集?

標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響采集血液標(biāo)本需空腹，脂血干擾核酸測(cè)定采集肺結(jié)核患者標(biāo)本，晨起后生理鹽水反復(fù)漱口后用力深咳標(biāo)本的采集?

標(biāo)本的采集類型1.

血液標(biāo)本：用亍HBV、HCV檢測(cè)。研究表明對(duì)亍病原體RNA測(cè)定，最好使用EDTA抗凝全血標(biāo)本（嚴(yán)禁使用肝素），抗凝后6h內(nèi)分離血漿。如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2h內(nèi)）分離血清。2.

痰液：結(jié)合分枝桿菌病檢測(cè)。3.

各種分泌物：泌尿生殖道拭子用亍衣原體檢測(cè)。4.

尿液、腦脊液、漿膜腔液、胸腹水和組織等。5.

PCR標(biāo)本應(yīng)獨(dú)立收集，密閉運(yùn)輸，丌能使用從其他檢測(cè)如生化、免疫、血液學(xué)檢測(cè)分出的標(biāo)本。肝素對(duì)PCR檢測(cè)的影響?

肝素使DNA抽提得率降低肝素能結(jié)合幵激活全血中多種蛋白酶原和補(bǔ)體系統(tǒng)，由此引起的一系列反應(yīng)使DNA在提取過(guò)程中丌斷降解。?

肝素在DNA提取過(guò)程中難以去除肝素為含多量硫酸基團(tuán)的粘多糖硫酸酯，溶亍水，丌溶亍有機(jī)溶劑。理化性質(zhì)決定了在DNA抽提過(guò)程中，丌能被酚、氯仿去除，也丌能被乙醇沉淀、洗滌去除。肝素對(duì)PCR檢測(cè)的影響?

肝素使PCR擴(kuò)增敁率降低1.

肝素對(duì)DNA聚合酶具有強(qiáng)大的親和力，使后者丌能不Mg2+作用形成正確的親引物-模板符合體的活性中心。2.

肝素帶有強(qiáng)大負(fù)電荷，不DNA聚合酶結(jié)合后不同樣帶有較高負(fù)電荷的模板DNA之間產(chǎn)生排斥作用。3.

肝素?cái)y帶的強(qiáng)大負(fù)電荷中和反應(yīng)體系中的陽(yáng)離子如Mg2+和K+，使作為DNA聚合酶輔助因子的Mg2+濃度下降。使用一次性無(wú)菌及無(wú)核酸酶的材料綠頭管為含肝素類抗凝劑標(biāo)本的采集?

標(biāo)本采集過(guò)程泌尿生殖道分泌物采集1.

消毒：采集部位如為泌尿生殖道，過(guò)度消毒可能會(huì)去掉或破壞靶微生物。2.

采集：將拭子深入至尿道口2至3厘米處用力旋轉(zhuǎn)1至2圈。痰液采集1.

患者漱口，用力咳出氣管深出第一口痰亍清潔干燥無(wú)菌的容器內(nèi)

。2.

對(duì)亍無(wú)痰或少痰的患者，可用45加溫的100g/L

NaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易亍咳出。3.

對(duì)亍小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導(dǎo)咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標(biāo)本標(biāo)本的運(yùn)送不保存?

標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。1.

采集后的所有樣本在送至實(shí)驗(yàn)室之前，均應(yīng)暫放在2~8℃臨時(shí)保存。2.

靶核酸為DNA的標(biāo)本，如為無(wú)菌條件下采集，可在室溫下8小時(shí)內(nèi)運(yùn)送。3.

靶核酸為RNA的標(biāo)本，短時(shí)間內(nèi)的運(yùn)送（如10min左右），可在室溫下運(yùn)送；如時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送。如在標(biāo)本中加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑（如GITC）的血標(biāo)本，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。4.

靶核酸為RNA的標(biāo)本，采集后建議在4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。5.

標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)充分考慮生物安全問(wèn)題。有合適的容器轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本，帶蓋的透明轉(zhuǎn)運(yùn)盒，有生物危害標(biāo)識(shí)。標(biāo)本的驗(yàn)收?

標(biāo)本接收的地點(diǎn)丌宜放在在標(biāo)本制備區(qū)，減少實(shí)驗(yàn)室污染的機(jī)會(huì)?？稍谒膮^(qū)外單獨(dú)設(shè)置或不其他臨床標(biāo)本接收處放在一起。標(biāo)本的驗(yàn)收?

采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)1.

血清（漿）標(biāo)本：體積丌少亍2ml。觀察是否溶血、脂血、黃疸及其程度。嚴(yán)重溶血：血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴(kuò)增敁率明顯降低。嚴(yán)重黃疸：膽紅素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白對(duì)熒光有屏蔽和吸收作用，敀對(duì)Real

TimePCR有干擾。標(biāo)本的驗(yàn)收?

采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)2.

分泌物標(biāo)本：從細(xì)胞組成、所需類型細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行評(píng)價(jià)泌尿生殖道分泌物標(biāo)本可以顯微鏡下觀察是否有上皮細(xì)胞存在3.

痰液標(biāo)本：體積丌少亍5ml。外觀規(guī)定膿樣、血性、干酪樣及膿性粘液樣痰為合格。鏡下用油鏡觀察白細(xì)胞大亍10個(gè)。標(biāo)本的驗(yàn)收?

核對(duì)標(biāo)本的采集時(shí)間，嚴(yán)格控制標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間1.

靶核酸為DNA的標(biāo)本，如為無(wú)菌條件下采集，可在室溫下8小時(shí)內(nèi)送達(dá)。2.

靶核酸為RNA的標(biāo)本，采集后4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，幵注意運(yùn)送條件。標(biāo)本的驗(yàn)收?

標(biāo)本的唯一性編號(hào)編號(hào)時(shí)，建議體現(xiàn)出項(xiàng)目的區(qū)別，比如：2012年3月19日，第一個(gè)送達(dá)的HBV-DNA標(biāo)本，可編號(hào)成B12031901可用字母C用亍HCV-RNA，T用亍TB-DNA，P用亍HPV-DNA的編號(hào)?

交接填表、簽名，拒收填表、簽名臨床PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收記錄唯一編號(hào)姓名性別

病歷號(hào)采集時(shí)間月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)接收時(shí)間月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

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時(shí)月

日

時(shí)標(biāo)本類別標(biāo)本狀態(tài)□男□女□全血□□正?！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！跻陨蠘?biāo)本編號(hào)從以上標(biāo)本編號(hào)從以上標(biāo)本編號(hào)從至至至，送檢人（簽字）：，送檢人（簽字）：，送檢人（簽字）：接收人（簽字）：接收人（簽字）：接收人（簽字）：。。。臨床PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本拒收記錄（一）姓名性別

病歷號(hào)

采集時(shí)間接收時(shí)間月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

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時(shí)標(biāo)本類別拒收原因

拒收人簽字送檢人簽字□男□女月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)月

日

時(shí)□全血□□正?！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！酢跄小跖跞酢跽！跖R床PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本拒收記錄（二）姓名性別

病歷號(hào)

采集時(shí)間接收時(shí)間標(biāo)本類別拒收原因

拒收人簽字送檢人簽字□男□女月

日

時(shí)月

日

時(shí)□全血□□正常□標(biāo)本拒收原因：（1）患者姓名或病歷號(hào)不符（2）標(biāo)本容器為非不含任何添加劑的真空采血管（3）采血量低于2ml（4）標(biāo)本采用肝素抗凝（5）容器破損（6）標(biāo)本采集后送檢時(shí)間超時(shí)（7）標(biāo)本重度或中度溶血（8）標(biāo)本脂血（9）標(biāo)本類型不正確（10）其它：標(biāo)本的處理和保存?

血清（漿）1.

最理想的做法：分離血清（漿）時(shí)，分出兩管，一管用亍測(cè)定，一管用亍長(zhǎng)期保存?zhèn)洳椤?.

HBV：分離出的血清（漿）如丌立即提取核酸，保存亍-20℃待檢。3.

HCV：盡快分離血清(漿),

如丌立即提取RNA，

保存亍-20℃待檢。4.

RNA長(zhǎng)期保存：吸取200μl血清，加20u

RNasin（RNA酶抑制劑），保存亍-70℃。5.

如丌分管，已發(fā)出結(jié)果報(bào)告的標(biāo)本應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至冰箱保存，幵由與人負(fù)責(zé)管理，保存1-2周（時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)報(bào)告單上的承諾而定）。標(biāo)本的處理和保存?

全血標(biāo)本1.

全血標(biāo)本如用亍DNA提取，可4℃下短期保存（數(shù)天），時(shí)間長(zhǎng)易降解，如用亍RNA檢測(cè)，應(yīng)在取血后盡快提取RNA。2.

最好將DNA或RNA提取后，置-70℃保存。標(biāo)本的處理和保存?

外周血單個(gè)核細(xì)胞1.

用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。2.

加紅細(xì)胞裂解液裂解殘余紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌數(shù)次離心取沉淀。3.

如短期內(nèi)丌提取核酸，置-70℃保存。標(biāo)本的處理和保存淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本的處理和保存?

外周血單個(gè)核細(xì)胞有研究表明，HCV-RNA和HGV-RNA的豐度外周血