瓊脂糖凝膠電泳技術的原理和方法

關于瓊脂糖凝膠電泳技術的原理和方法第1頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月一實驗目的學習瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法檢測堿裂解法提取質(zhì)粒的結果檢測雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒的結果（后續(xù)實驗）檢測PCR法鑒定質(zhì)粒的結果（后續(xù)實驗）第2頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月二實驗原理（1）某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構型有關。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。（2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。第3頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2

配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。（3）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可判斷DNA分子量大小和粗略估計樣品DNA濃度。表1瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分子大小的關系第4頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月三儀器、材料與試劑1.質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCR樣品。2.凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)(凝膠成像系統(tǒng))等。3.瓊脂糖、

1XTAE電泳緩沖液、Goldview、

6X載樣緩沖液（

6Xloadingbuffer）和DNA分子量標準（Marker）等。第5頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月1.凝膠電泳系統(tǒng)DYY-6C型

雙穩(wěn)定時電泳儀電源（北京六一）輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V)

4-400mA

(1mA)

240W美國Bio-rad伯樂小型水平電泳槽Mini-SubCellGTCell第6頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.凝膠成像分析系統(tǒng)第7頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Marker一個已知分子質(zhì)量的DNA樣品做最對照，用來確定待測樣品的相對分子質(zhì)量。第8頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月4.常用電泳緩沖液緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度復雜DNA混合物；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價格昂貴，不常用TPE電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.上樣緩沖液第9頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月4.常用核酸染料名稱優(yōu)點缺點EB

（溴化乙錠）染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中或膠中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。Gldview低毒，靈敏度較高的染料；可以加入樣品中。dsDNA呈現(xiàn)綠色熒光,而ssDNA呈紅色熒光,能較好地區(qū)分dsDNA與ssDNA。

價格稍高，靈敏度較低。背景強烈。SYBR新型低毒，高靈敏度染料，可以加入樣品中。價格昂貴。對小于50bp染色缺失，小于100的染色效果較差。穩(wěn)定性差Genefinder花青類染料,毒性很低；最大吸收峰為470nm。具有安全、靈敏、經(jīng)濟的特點

重復性較差。能引起有機體突變。第10頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠溴化乙錠（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EB），EB染色（EB可很好地摻入到雙鏈DNA中），在紫外光下會發(fā)出橙紅色的熒光，用于對DNA進行染色和觀察。用于觀察的紫外光有３種波長，一般使用中波紫外光（302nm）。短波紫外光（254nm）觀察效果較好，但對DNA的破環(huán)很大。長波紫外光（366nm）：回收。第11頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月1.制備瓊脂糖凝膠（1%）2.制備凝膠板3.加樣4.電泳5.染色6.結果觀察

四.實驗步驟第12頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月1.制備凝膠和膠板：

20ml(1×TAE)+0.2g瓊脂糖（三角瓶

），煮膠，溶解，冷卻至60℃(不燙手)，倒板，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子。膠板設計（27人）：每11孔膠板（4人：2樣品+1marker）。第13頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月5μl質(zhì)粒DNA+1μlloadingbuffer混勻；15μlPCR產(chǎn)物+3μlloadingbuffer，混勻；10μl酶切產(chǎn)物+2μlload-ingbuffer混勻；5μlDNAMarker(每板膠一孔）2.加樣第14頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月3.電泳電壓3-5V/cm，約80-90V，注意電極方向第15頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月4.觀察紫外透射分析儀下觀察。第16頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月六實驗結果第17頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其