生物發(fā)光原理及的應用

關于生物發(fā)光原理及的應用第1頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO

生物發(fā)光，即用熒光素酶基因標記細胞或DNA，直接監(jiān)控活體生物體內的細胞活動和基因行為

。觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程。相比于傳統(tǒng)（通過不同時間點宰殺實驗動物而獲得數(shù)據(jù)）的方法，對一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，更可靠。

問傾虎搗贏衍悔揭簿途診凸早莢鄖活剩迎析掃湖未整奇及泥黍給絲性素紀生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第2頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO一，技術原理二，技術應用三，技術優(yōu)勢遮魚毆叮櫻長榨隴平腋夏瞞異之邦夸謬擲崔實邁周紹描巒史器罷餌唁弧皚生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第3頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO一、技術原理（1）標記原理（2）光學原理（3）實驗過程

號弘訪掙譬疽犬仔唇藍突畫汰搭夜咖磺穩(wěn)抱州賬藕乏氫拂適燥妖超償韓本生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第4頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標記細胞的數(shù)目線性相關。（1）標記原理

碳溝空膜疥患停轍徘聲腮短崎僅昨寬賴契心價磊抄旁恭飛鳥蘆涕店授官采生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第5頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO

通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶的基因插到預期觀察的細胞的染色體內，通過單克隆細胞技術的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，將標記好的細胞注入小鼠體內。觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素。熒光素脂溶性非常好，很容易透過血腦屏障?！黾s一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光；■十分鐘后強度達到最高；在最高點持續(xù)約20～30分鐘后開始衰落，約三小時后發(fā)光全部消失。■最好的檢測時間是在注射后15到25分鐘之間。牢右樓詢常琵癬寓藕馱酪郊攆亭外快七庭抒拳嚷嗡卿原逸闡友斌地稗渾療生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第6頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO

每次熒光素酶催化反應只產(chǎn)生一個光子：IVIS

（infraredvideodataimagingsystem紅外視頻數(shù)據(jù)成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)）★一個高度靈敏的制冷CCD相機

——將光學信號轉化為數(shù)字信號；★特別設計的成像暗箱和成像軟件可——屏蔽宇宙射線在內的所有射線

——觀測、記錄并分析這些信號射斂或斤守榨熙剃盂琺繕柵紳淵塌鴦章旭誨妖歡換驅錘傭廂壤未掀剖趾典生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第7頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO

光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，在偏紅光區(qū)域，大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到（衍射）。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關系。軟件為每一次使用提供一張圖片作為數(shù)據(jù)結果，記錄了發(fā)射出的光子數(shù)據(jù)。顏色體現(xiàn)了單位面積中發(fā)射光子的數(shù)量，信號強度高的為紅色，低的為紫色。（2）光學原理

萎辭綢茂緯掀遞螺瓦誹動墳勤摻肚保匙納意叮蛙勻琶伯征碳冊炮忠煙餡琢生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第8頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO◆麻醉系統(tǒng)麻醉小鼠后放入成像暗箱平臺◆軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖?！糇詣雨P閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像?！襞c第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內光源的位置，完成成像操作。

（3）實驗步驟

贍披倡怎瘦蕭李桓即擻懂底智樊養(yǎng)蘊吁追騁肆畦區(qū)淡獨俗擴嘉孕果總貞蹭生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第9頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO

軟件完成圖像分析過程：使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。

嘆靶眩峨牧著頻溜吼路念蹬姿杯濘籬蓑革摧棉鱗泣南閘暖括鹼孵鈍穆埃剮生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第10頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO二、技術應用（1）標記細胞（2）標記病毒（3）標記細菌（4）基因表達和蛋白質的相互作用（5）轉基因動物模型

源外柏騰倦婿拱酉擰橋壤埋示氏誕是晶步畏謗領鴕凹省停玄榴載萬扁遠玫生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第11頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（1）標記細胞◆癌癥與抗癌藥物研究

直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估?；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發(fā)瘤。

通過給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量，并不同的給藥時間、不同的給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。樸譏擄滿樓返障粒揍蟲饞身冪匡駕久拔濺槽蘭益丘爸躥遇三酸邊孕祈誣身生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第12頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（1）標記細胞◆癌癥與抗癌藥物研究

●U251-HRE細胞：其中的熒光素酶基因表達受可誘導啟動子的操控，低氧狀態(tài)為其誘導條件。當腫瘤發(fā)展到300~500mg時，局部組織低氧（微環(huán)境），表達；●組織切片也可以觀察到生物發(fā)光，熒光素酶的體外活性保持時間比較短，約幾十分鐘；●已商品化的腫瘤細胞株包括：前列腺癌，乳腺癌，子宮頸癌和結腸癌等細胞系模型。祟桿得致混揖緘緒抨漲泵死玲噸操姆搓恫具亂嶄梭彥精謄箕碩暇刁八鈣燴生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第13頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（1）標記細胞◆免疫學與干細胞研究

將熒光素酶標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內干細胞造血過程的早期事件及動力學變化。有研究表明，應用帶有生物發(fā)光標記基因的小鼠淋巴細胞，檢測放療及化療效果。

●可觀察流體細胞在體內的動向和變化；●能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉移途徑。燈挪醋碳綜朱薩涯蔬為殲孜短契縛按夾口甕影佳族營鉆邊備履油潰拜邦赤生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第14頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（1）標記細胞◆細胞凋亡

當熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發(fā)光；而當細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3（細胞凋亡蛋白酶）在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象?！駲z測正在凋亡的細胞狀況。

社錨諾炔縣響蝕顴緬以婚往灑蜂路滴輛誕潤活別買簽系歷都鐘狂壩蜜磅馱生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第15頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（2）標記病毒◆病毒侵襲

以熒光素酶基因標記的HSV-1（1-型單純皰疹病毒herpessimplexvirus1）病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結的侵襲和病毒從血液系統(tǒng)進入神經(jīng)系統(tǒng)的過程?！穸喾N病毒，腺病毒，腺相關病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。戮韭蔡淪瀝氖簡居待夾仇孽棧膽窟挾戴籃淌碟惱癢冰飄耳磨欠綸賢貍僥戈生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第16頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（3）標記細菌◆細菌侵染研究

可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物，觀測其在動物體內的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應。孤僥陋嗅蚜把百隱妄運惰膨螞梅奧痊睛肅潛栓殿父國炔壬猜絡任刑暫茸釋生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第17頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（3）標記細菌◆抗生素藥物研究

利用標記好的細菌在動物體內對藥物的反應，醫(yī)藥公司和研究機構可用這種成像技術進行藥物篩選和臨床前動物實驗研究?！窠陙?，國際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術在動物體內的實驗結果作為FDA（美國食品和藥品檢驗局）藥物申報材料中非常重要的臨床前動物實驗部分。腕兒圓空活劑漚尚訃勺脊壽鏈噎攻掄舵拿限荷畢草粱招訝輛詐短剛你脊幾生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第18頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（4）基因表達和蛋白質相互作用◆組織特異性基因表達

一種細胞可被兩種熒光素酶標記：renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅動，作為內參，反應細胞數(shù)量的變化；firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅動?！襁@樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細胞數(shù)量變化的影響后就可反應特定的啟動子在動物體內的表達活性。鵑縫蝦淘俺彭浮棟郝堿犬顴痞刀噸搓諷賄超駝條葷怕捍坷聾治傻冬瑰滴刻生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第19頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（4）基因表達和蛋白質相互作用◆基因治療

基因治療包括在體內將一個或多個感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效地傳遞到靶細胞。●應用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內持續(xù)高效和組織特異性表達；●插入脂質體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質體為載體的DNA運輸和基因治療情況:容易準備、低毒性及輕微免疫反應。菩韭菇叫巖忱疆售羔戳恃潰壘欽崇鐘盎訟陡甫凳泅擾鼠鋁甩喲膝純肇剃廓生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第20頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（4）基因表達和蛋白質相互作用◆蛋白質相互作用

將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導入細胞或動物體內表達為融合蛋白。當兩種蛋白有強相互作用時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。

●此原理亦可用于研究細胞信號傳導途徑。寵繞絳鈔涉淬蔭牡哮秧誕秀錠名譽戀娘贖萬敏杭降均揪娶粘芍晉征罐矮管生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第21頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（5）轉基因動物模型◆基因表達

將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。利用其表達產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應目的基因的表達情況（何時、何種刺激下表達），從而實現(xiàn)對目的基因的研究?！駝游锇l(fā)育過程中特定基因的時空表達情況；●觀察藥物誘導特定基因表達；●其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。減涪風螟六起匈降灘倔捕氣擬秧娠贏扁猶屠瘩摹豌拔讀洽枕蚊譬膠南臟悔生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第22頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO（5）轉基因動物模型◆各種疾病模型

研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉入動物體內形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等?！裉峁┌谢蛟隗w內的實時表達和對候選藥物的準確反應；●評估候選藥物和其它化合物的毒性；●為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。睬歇腆媚承睛抿裕盼冠纓苦淀低掩震汰哨衰攝耪透靶人疚丈拎烴艾矚汀盤生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第23頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO三、技術優(yōu)勢

腫瘤轉移研究，基因治療，流行病學的發(fā)病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關研究等是該技術非常有優(yōu)勢的領域。在藥物開發(fā)方面，用該技術進行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因疾病動物模型，來快速直觀的進行相關疾病的發(fā)病機理和藥物篩選研究。慧敢哨乞記瑪遂你漸疑家朋嘴畢散莢筑譴念茅橙嘶巍衫窘窗膨劇晨抨痞訃生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第24頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO三、技術優(yōu)勢

（1）無創(chuàng)傷性，可快速掃描，一天可檢測幾百只；（2）有更高的靈敏度，可以在感染早期就進行活體觀察；（3）可以有結構信息，在活體動物整體上觀察感染途徑；（4）對同一批老鼠自身對照，有效持續(xù)觀察，減少實驗時間和經(jīng)費，避免個體間差異；（5）定量結果：實驗結果以靶細胞單位時間內發(fā)射光子數(shù)的絕對量表示，它與標記的靶細胞數(shù)量或基因表達情況直接線性相關。懂與兔客鈕鉆啦條怨胡劍初鏟張胞敲允臀鋼枕霹近敏錠試螢詞鉚猖完俐倫生物發(fā)光原理及的應用生物發(fā)光原理及的應用第25頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月LOGO熒光素酶的穩(wěn)定性◆熒光素酶基因是插到細胞染色體內的，當細胞分裂、轉移、分化時，熒光酶