植物細(xì)胞雜交及雜種鑒定研究進(jìn)展

植物細(xì)胞雜交及雜種鑒定研究進(jìn)展第一頁(yè)，共12頁(yè)。摘要:植物體細(xì)胞雜交使遠(yuǎn)緣雜交不親和的植物有可能實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)重組,創(chuàng)造和培養(yǎng)植物新品種乃至新物種,尤其在多基因控制農(nóng)藝性狀的改良上具有較大優(yōu)勢(shì).隨著原生質(zhì)體融合技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,體細(xì)胞融合再生植株的植物種屬范圍不斷擴(kuò)大,雜種鑒定的方法和手段也有了很大提高.本文就近年來(lái)植物體細(xì)胞雜交的技術(shù)手段、篩選體系和雜種檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述,并展望了其應(yīng)用和發(fā)展前景。關(guān)鍵字：體細(xì)胞雜交不對(duì)稱雜交細(xì)胞融合雜種鑒定原生質(zhì)體融合技術(shù)第二頁(yè)，共12頁(yè)。[1]植物細(xì)胞在組織培養(yǎng)過(guò)程中另一特別之處在于其體細(xì)胞雜交過(guò)程中克服了因兩種植物種源不同而造成的融合障礙，繁榮了物種的多樣性。并使細(xì)胞雜交后的產(chǎn)物表現(xiàn)出兩種物種的性狀與功能。通過(guò)選取具有優(yōu)良品種的個(gè)體進(jìn)行雜交，得到符合要求的雜種細(xì)胞，并應(yīng)用于生物技術(shù)使之大規(guī)模生產(chǎn)。另外，在已分離篩選的雜交細(xì)胞中進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕唬訌?qiáng)培育分化且遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)株。正文：植物體細(xì)胞雜交廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，是當(dāng)今生物科學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最大不同之處在于植物組織細(xì)胞的外植體在離體條件下經(jīng)過(guò)人為的培養(yǎng)可以生長(zhǎng)分化為完整的植株，進(jìn)而保持了植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的全能性，使植物物種的生長(zhǎng)存活較動(dòng)物細(xì)胞更具有廣泛性。植物體細(xì)胞雜交（plantsomatichybridization）,又稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過(guò)人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。植物的原生質(zhì)體融合一般用聚乙二醇或滅活的仙臺(tái)病毒的化學(xué)方法融合，也可以用電融合誘導(dǎo)得物理方法，其融合的實(shí)質(zhì)就是在誘導(dǎo)劑存在下，兩個(gè)親本細(xì)胞的細(xì)胞膜相互接觸和形成類似融合管類的膜狀結(jié)構(gòu)，然后胞質(zhì)的內(nèi)含物彼此相容，兩個(gè)細(xì)胞核相互靠近，在細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合后，細(xì)胞核基因組相互發(fā)生遺傳重組的過(guò)程。第三頁(yè)，共12頁(yè)。

下面以番茄馬鈴薯體細(xì)胞雜交為例來(lái)具體說(shuō)明雜交過(guò)程。雜交原理：利用細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性培育雜交細(xì)胞和植株。技術(shù)應(yīng)用：細(xì)胞融合技術(shù)；植物組織培養(yǎng)技術(shù)理論根據(jù)：番茄和土豆都是二倍體植株；其遺傳物質(zhì)都是DNA，編碼蛋白質(zhì)時(shí)，都共用一整套三聯(lián)體密碼子，另外基因遺傳信息的走向都遵循中心法則，番茄和土豆在雜交過(guò)程中不存在阻礙核質(zhì)融合的抑制因子及基因。植物組織的處理及操作步驟：1）選取番茄和土豆的芽尖或莖尖,切為薄片,浸在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的漂白粉或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaClO溶液中5-15min后取出，用無(wú)菌水沖洗4-6次.備用。第四頁(yè)，共12頁(yè)。2）制備原生質(zhì)體:將番茄組織片和土豆組織片分別放入兩支試管,都加入等滲濃度的纖維素酶和果膠酶溶液,使細(xì)胞壁酶解,形成單個(gè)的原生質(zhì)體,取出,分別裝在無(wú)菌試管中.在番茄試管中加入紅色熒光染料,土豆試管中加入綠色熒光染料,標(biāo)記細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì),形成紅色番茄原生質(zhì)體和綠色土豆原生質(zhì)體.第五頁(yè)，共12頁(yè)。7）誘導(dǎo)生根（形成試管苗）:將胚狀體移植到生根培養(yǎng)基上,每天在2000lx的光強(qiáng)下光照10h，控溫20℃。待生出幼根后，改為2000-5000lx光強(qiáng)，進(jìn)行自然生長(zhǎng)形成試管苗。8）煉苗與移栽（試管苗的生長(zhǎng)）：在試管苗中加入生長(zhǎng)延緩劑（矮壯素），使株高降低，莖根加粗，同時(shí)逐步加強(qiáng)光照至自然光.培養(yǎng)2周后,將幼苗移栽至用0.2%的KMnO?處理過(guò)的珍珠巖上培養(yǎng).煉苗1-2周后,即可移栽入大田,進(jìn)行粗放管理。

3）原生質(zhì)體的融合:將紅色番茄原生質(zhì)體和綠色土豆原生質(zhì)體一同放入電場(chǎng)誘導(dǎo)融合器,電離1-3min后,施加脈沖電流,在細(xì)胞膜上打孔,使相互接觸的原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)混合,細(xì)胞膜流動(dòng)連接.4）雜種原生質(zhì)體的篩選:在顯微鏡下,將顏色為紅綠相間或褐色的雜種原生質(zhì)體分離出.5)脫分化（形成愈傷組織）:將雜種原生質(zhì)體放入誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基中，用無(wú)菌棉塞緊瓶口，蓋上專用瓶蓋,在黑暗條件下控溫15-20℃,培養(yǎng)10d左右，形成肉眼可見(jiàn)、無(wú)固定形態(tài)、排列松散的細(xì)胞群體，即愈傷組織.6）再分化（形成胚狀體）：將愈傷組織移植到分化芽的培養(yǎng)基中，每天在1000-2000lx的光強(qiáng)下光照10h，控溫20℃，分化出幼芽，形成胚狀體.第六頁(yè)，共12頁(yè)。原生質(zhì)體融合示意圖植物體細(xì)胞雜交所應(yīng)注意的問(wèn)題：1）在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)過(guò)程中融合劑在誘導(dǎo)細(xì)胞融合時(shí)也會(huì)對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害作用，因此用量要少。2）植物脫壁后形成的原生質(zhì)體必須處于高滲或等滲的溶液環(huán)境中，低滲透壓下細(xì)胞容易漲破。3）在制備原生質(zhì)體時(shí)，使用相應(yīng)的酶制劑作用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則過(guò)量的酶解液也會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，使原生質(zhì)體再生率低4）隨機(jī)產(chǎn)生的融合子很有可能是無(wú)效融合進(jìn)而產(chǎn)生的雜交細(xì)胞不育，雜交成功后也不會(huì)有預(yù)期想要的性狀。第七頁(yè)，共12頁(yè)。經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不對(duì)稱性育種：[2]不對(duì)稱體細(xì)胞雜交即指利用射線將供體原生質(zhì)體鈍化,并破壞其染色質(zhì),與未經(jīng)輻照的受體原生質(zhì)體融合。由于所得融合產(chǎn)物含全套受體染色體及部分供體染色體,故稱不對(duì)稱體細(xì)胞雜種,這類體細(xì)胞雜交稱為不對(duì)稱體細(xì)胞雜交,亦有人形象地稱為γ或χ融合。誘導(dǎo)形成的不對(duì)稱性雜種指的是遠(yuǎn)源的種之間要得到細(xì)胞有用的雜種植株就必須使融合產(chǎn)生的細(xì)胞核基因組分發(fā)生高度的不對(duì)稱性也就是達(dá)到是供體的少量基因組分導(dǎo)入或整合到受體基因組去。一般是通過(guò)誘導(dǎo)供體的細(xì)胞核物質(zhì)大部分丟失或通過(guò)一定劑量的理化因子處理使供體細(xì)胞的細(xì)胞核失活，再和受體經(jīng)誘導(dǎo)融合得到胞質(zhì)雜種[3]近年來(lái)，不對(duì)稱融合方法的建立，即通過(guò)物理或化學(xué)因子來(lái)處理供體原生質(zhì)體，是親本供體一方僅以胞質(zhì)基因或部分核基因轉(zhuǎn)移到受體一方，從而直接獲得不對(duì)稱雜種，為在遠(yuǎn)源不親合的種間或?qū)匍g的體細(xì)胞雜交創(chuàng)造了有利的條件，增加了獲得可育再生的植株可能性。kasaka和kamega

[4]報(bào)告用x射線照卡那霉素和鏈霉素雙抗番茄植株的葉肉原生質(zhì)體，再與胞質(zhì)雄性不育的胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行電融合，經(jīng)過(guò)選擇得到形態(tài)上類似胡蘿卜的再生植株，使他的染色體組低于雙親染色體組之和。上述研究方法表明體細(xì)胞雜交不僅能夠克服由有性生殖所造成的遠(yuǎn)緣雜交障礙，并且能夠農(nóng)藝性狀的不足。因此植物體細(xì)胞雜交在轉(zhuǎn)移抗逆性狀，進(jìn)行作物改良，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣重組，定向轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因，進(jìn)而創(chuàng)造新品種等方面都有重要作用。第八頁(yè)，共12頁(yè)。雜種細(xì)胞選擇與鑒定：1雜種細(xì)胞選擇親原生質(zhì)體融合時(shí)，可分為自體融合和異體融合兩大類。自體融合的結(jié)果得到同核體，由不同雙親、原生質(zhì)體融合得到異核體。與同核體相比，融合后的異核體在人工培養(yǎng)基上分裂分化并不占優(yōu)勢(shì)。通常由于啟動(dòng)分裂和持續(xù)分裂緩慢，而受到同核體的抑制，不能發(fā)育成為雜種植株。所以必須建立或設(shè)計(jì)出一套方法，優(yōu)先選擇細(xì)胞雜種植株。其中最為直觀的選擇方法是雙熒光標(biāo)記選擇法。[6]雙熒光標(biāo)記選擇法：Patnik和Coking等1982年在進(jìn)行原生質(zhì)體融合時(shí)，親本一方是懸浮細(xì)胞來(lái)的原生質(zhì)，因其沒(méi)有葉綠體，有異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記時(shí)會(huì)發(fā)出“蘋(píng)果綠”熒光；另一親本是含有葉率體的葉肉細(xì)胞，會(huì)發(fā)紅光。二者形成的異核體（雜種細(xì)胞）在熒光顯微鏡下會(huì)同時(shí)發(fā)出蘋(píng)果綠熒光和紅光熒光，因此可方便地把雜種細(xì)胞分揀出來(lái)，加以培養(yǎng)。第九頁(yè)，共12頁(yè)。2，雜種細(xì)胞的鑒定①形態(tài)學(xué)鑒定這種方法是鑒定雜種的最準(zhǔn)確的方法。因?yàn)橐谛螒B(tài)上表現(xiàn)出雜種性來(lái)，就必須有內(nèi)部的大量基因的協(xié)調(diào)活動(dòng)，而且基因的活動(dòng)必須和細(xì)胞的活動(dòng)取得了協(xié)調(diào)。但經(jīng)愈傷組織途徑再生植株與原生質(zhì)融合產(chǎn)生的變異很難區(qū)別，因此僅以來(lái)形態(tài)特征來(lái)判斷不太可靠，尚需配合其他方法。②細(xì)胞學(xué)觀察應(yīng)用染色體計(jì)數(shù)方法、核型分析和顯帶技術(shù)以親本為對(duì)照，對(duì)雜種細(xì)胞的染色體數(shù)目、大小與形態(tài)的變化等進(jìn)行觀察比較。此法優(yōu)于形態(tài)學(xué)鑒定，對(duì)親源關(guān)系遠(yuǎn)的雜種細(xì)胞的判斷準(zhǔn)確性較好。③同工酶分析一般以雙方親本的同工酶譜帶作為對(duì)照，雜種細(xì)胞都具有雙親譜帶的總和。有時(shí)還出現(xiàn)新的譜帶，則說(shuō)明融合產(chǎn)物是異源性的。應(yīng)用于分析的同工酶很多，已成功使用的有過(guò)氧化物酶、乳酸脫氫酶、脂酶、氨肽酶等。由于植物在不同的發(fā)育階段，在不同的組織中，同工酶譜帶本身可以有較大的差異，因此進(jìn)行這方面的比較時(shí)，應(yīng)注意取樣的部位和時(shí)間要嚴(yán)格一致。④分子標(biāo)記鑒定分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展對(duì)于分析體細(xì)胞雜種的遺傳構(gòu)成有重大的促進(jìn)作用。采用核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析，將使鑒定結(jié)果更精確。第十頁(yè)，共12頁(yè)。植物細(xì)胞在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用⑴微繁殖技術(shù)（Micropropagation）的應(yīng)用應(yīng)用微繁殖技術(shù)既可用于克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的后代嚴(yán)重分離，如澳大利亞的番木瓜；有可用于名優(yōu)或?yàn)l危物種的快速繁殖，如鳳梨、草莓。通過(guò)