吳永平-動(dòng)物檢疫技術(shù)

吳永平TelQ:151442456;Email：wypzxd2002@163.com《動(dòng)物防疫與檢疫》大家下午好！1目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第五章動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)第一節(jié)檢驗(yàn)檢疫樣品第二節(jié)細(xì)菌分離及鑒定第三節(jié)病毒分離及鑒定第四節(jié)其他病毒微生物分離及鑒定第五節(jié)寄生蟲檢查第六節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用2目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第一節(jié)檢驗(yàn)檢疫樣品一、病料采集和運(yùn)送1、在采取病料前必須對(duì)被檢動(dòng)物可能患有何種疫病作出初步診斷；2、采取病料所用的容器、手術(shù)器械均應(yīng)滅菌后才能使用，采樣時(shí)應(yīng)無菌操作；3、解剖前檢查（只有在確定不是炭疽后，方可剖解）；4、取材時(shí)間要早（死后6h內(nèi)）；5、應(yīng)根據(jù)不同的疫病相應(yīng)的采取臟器或內(nèi)容物；若無法估計(jì)是某種疫病，可全面的采取。（膿汁、血液、皮膚、骨頭、腦、脊髓等）3目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)二、病料的保存（一）細(xì)菌檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→保存于飽和氯化鈉溶液或30%甘油緩沖鹽溶液中→容器加塞封固。液體→裝地封閉的毛細(xì)玻管或試管運(yùn)送。生前由直腸中采集的糞團(tuán)→裝入滅菌容器中寄送。（二）病毒檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→保存于50%甘油緩沖鹽溶液或雞蛋生理鹽水中→容器加塞封固。（三）病理組織學(xué)檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→放入10%福爾馬林溶液或95%酒精中固定，固定液用量應(yīng)為病料的10倍。4目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)三、病料的記錄、包裝和運(yùn)送方法（一）送檢單填寫3份，一份存根，兩份寄送檢驗(yàn)室；待檢查完畢后退回1份。（二）病料的包裝和運(yùn)送液體病料（如黏液、滲出液、尿及膽汁等）→裝入細(xì)玻璃管中（管口用火焰封閉）→再用廢紙或棉花包囊裝入較大的試管中→再裝入木盒中運(yùn)送。組織塊或臟器5目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第二節(jié)細(xì)菌分離及鑒定細(xì)菌分離及鑒定是用人工的方法使細(xì)菌在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)繁殖，獲取純種、進(jìn)行鑒定與研究等。為達(dá)到細(xì)菌分離及鑒定的目的，運(yùn)用無菌技術(shù)提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基適宜的培養(yǎng)方法和條件6目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)六、細(xì)菌的分離接種平板劃線接種法斜面接種法傾注培養(yǎng)法穿刺培養(yǎng)法半固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法平板涂布培養(yǎng)法七、細(xì)菌的培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法（CO2孵箱法、燭缸法、化學(xué)法）厭氧培養(yǎng)法（厭氧罐培養(yǎng)法、培養(yǎng)箱法）7目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)八、細(xì)菌的鑒定（一）細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象觀察8目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)細(xì)菌的一些培養(yǎng)特征有小刺在瓊脂穿刺培養(yǎng)中的生長(zhǎng)絨毛狀假根狀樹狀念珠狀有小刺念珠狀假根狀樹狀擴(kuò)展?fàn)罱z狀絲狀在瓊脂劃線培養(yǎng)上的生長(zhǎng)量杯狀漏斗狀囊狀層狀蘿卜狀在明膠穿刺培養(yǎng)中的生長(zhǎng)絮狀環(huán)狀膜狀肉湯表面生長(zhǎng)浮膜狀9目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（二）、細(xì)菌基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)的觀察細(xì)菌基本形態(tài)的觀察細(xì)菌基本形態(tài)：球狀、桿狀和螺旋狀。細(xì)菌基本結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、莢膜等。均需染色方可在顯微鏡下觀察，染色方法有：簡(jiǎn)單染色法：只用一種染料進(jìn)行染色。復(fù)雜染色法：革蘭氏染色法抗酸染色法（抗酸菌呈紅色，非抗酸菌呈藍(lán)色）瑞特氏染色法（細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色）姬姆薩氏染色法（細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色）10目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)細(xì)菌特殊形態(tài)的觀察11目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（三）生化試驗(yàn)細(xì)菌的生化試驗(yàn)是繼形態(tài)學(xué)鑒定之后，又一重要鑒別依據(jù)。糖類分解試驗(yàn)吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)V-P試驗(yàn)甲基紅（M.R）試驗(yàn)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)萄遄吓Ｈ樵囼?yàn)硫化氫試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)12目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（四）、細(xì)菌抗原檢測(cè)及血清型鑒定◎細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，有存在于細(xì)胞壁的菌體抗原（O抗原，有運(yùn)動(dòng)性的細(xì)菌在菌體抗原之外還有鞭毛抗原（H抗原），具有不同種、型特異性。◎血清型鑒定首先要求鑒定的細(xì)菌必須純凈、新鮮，在適宜條件下培養(yǎng)，盡量減少偉代，以防發(fā)生變異。其次有特異性強(qiáng)和效價(jià)高的已知標(biāo)準(zhǔn)血清（包括單克隆抗體）和標(biāo)準(zhǔn)菌株。（五）、細(xì)菌遺傳物質(zhì)檢測(cè)目前比較成熟的遺傳物質(zhì)檢測(cè)包括基因探針技術(shù)和PCR技術(shù)13目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（六）、細(xì)菌毒力測(cè)定表示細(xì)菌毒力大小的單位有：最小致死量（MLD）：能使特定的動(dòng)物感染后，在一定時(shí)限內(nèi)發(fā)生的最少活的細(xì)菌量或毒素量。半致死量（LD50）：在一定的時(shí)限內(nèi)能使半數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染后發(fā)生死亡所需的活的細(xì)菌或毒素量。14目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第三節(jié)病毒分離及鑒定檢材的采集與送檢、病料的處理標(biāo)本采取的原則：1.病毒標(biāo)本的采取應(yīng)盡早為好.2.由于大多數(shù)病毒對(duì)熱不穩(wěn)定，應(yīng)該立即接種，如果不能及時(shí)接種或需保存，一般置50％甘油鹽水4℃或一20℃以下保存。15目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)三、病毒的分離培養(yǎng)一、動(dòng)物接種培養(yǎng)二、病毒的雞胚培養(yǎng)三、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)16目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)一、動(dòng)物接種培養(yǎng)動(dòng)物接種是最原始的病毒培養(yǎng)方法。主要用于目前無法用細(xì)胞、雞胚培養(yǎng)的病毒。常用的動(dòng)物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、家兔，有時(shí)也用猴、猿、猩猩等。接種時(shí)要根據(jù)病毒對(duì)動(dòng)物，組織細(xì)胞等嗜性不同而選擇特定的部位，如鼻腔、皮內(nèi)、皮下、腹腔、腦內(nèi)、靜脈等。小白鼠腦內(nèi)接種法【材料】1.腦炎病毒（小白鼠腦脊髓炎）懸液：腦組織先用無菌生理鹽水洗去血液，再加100％脫脂奶水研磨成10毫升懸液，離心沉淀30分鐘，吸取上清液。2.小白鼠：3周齡，體重6—8克。17目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)【方法】

1．1毫升注射器抽取腦炎病毒懸液0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。2．取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時(shí)用大拇指和食指握住小白鼠的頭部，左手掌輕輕按住小白鼠的體部。3．右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠的右頰部皮毛4．右手拿住注射器在小白鼠眼與耳根連線的中點(diǎn)略偏耳朵的方向注入，進(jìn)入顱腔，進(jìn)針2—3毫米，不要插得太深，注射量為0.02—0.03毫升。5．注射完畢，將用過的注射器煮沸消毒，動(dòng)物一般在3—4天開始發(fā)病，食欲減退，活動(dòng)遲純、聳毛、振顫、慢慢發(fā)展為麻痹癱瘓而死亡。18目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)二、病毒的雞胚培養(yǎng)19目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)三、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)通過機(jī)械解離或消化等方法將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，稱為細(xì)胞培養(yǎng)。病毒的細(xì)胞培養(yǎng)步驟：病料處理病毒分離、繁殖細(xì)胞病變（CPE）觀察20目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)四、分離病毒的鑒定（一）病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察（二）病毒核酸類型的測(cè)定（三）病毒對(duì)幾種類脂的敏感試驗(yàn)（四）病毒對(duì)幾種理化因素的抗性測(cè)定（五）血吸附和血吸附抑制試驗(yàn)（六）干擾素敏感試驗(yàn)（七）蝕斑形成單位測(cè)定（八）病毒毒力的測(cè)定（九）血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)（十）中和試驗(yàn)（十一）血清學(xué)試驗(yàn)21目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（一）病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察禽流感病毒狂犬病病毒22目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（二）病毒核酸類型的測(cè)定胸苷酸是病毒DNA合成的重要物質(zhì)，它的鹵素替代物的存在能抑制DNA的合成。【方法】：1、給已長(zhǎng)滿細(xì)胞單層6孔板1-4孔每2孔加病毒液3滴；2、置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中1h；3、取出細(xì)胞板，吸出培養(yǎng)液；4、給相應(yīng)的孔加5ml含胸苷酸的類同物的維持液或不含胸苷酸的類同物維持液；5、將細(xì)胞培養(yǎng)板放回CO2培養(yǎng)箱中，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。23目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（三）病毒對(duì)幾種類脂的敏感試驗(yàn)病毒有無包膜，常用脂溶劑氯仿、乙醚或去氧膽酸鈉來處理病毒，看脂溶劑對(duì)病毒有無滅活作用而證明病毒有無包膜。以氯仿敏感試驗(yàn)為例：1、將氯仿加于病毒懸液中，使最終濃度達(dá)5%，充分振蕩后在4℃放置10min.2、懸液用2000r/min離心沉淀5min，使氯仿沉于管底。3、吸取上層液，做連續(xù)10倍稀釋。每一稀釋接種4管細(xì)胞培養(yǎng)，滴定組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）。未經(jīng)氯仿處理的病毒懸液做同樣處理。4、氯仿處理的病毒懸液的感染力如比對(duì)照懸液低2.0log以上即可認(rèn)為是敏感。24目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（四）病毒對(duì)幾種理化因素的抗性測(cè)定1、熱滅活試驗(yàn)

有些病毒對(duì)熱敏感在50℃30min被滅活。2、陽離子穩(wěn)定試驗(yàn)高濃度二價(jià)離子如MgCl2能穩(wěn)定某些病毒如腸道病毒等，使其在50℃60min不被滅活。另一些病毒如腺病毒等則增加對(duì)熱的敏感性。3、酸敏感試驗(yàn)在pH3溶液中經(jīng)30min能降低某些病毒的感染力如口蹄疫病毒，而對(duì)另一些病毒如豬水皰病毒等沒有作用。25目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（五）血吸附和血吸附抑制試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)被某些病毒感染后，不論有無細(xì)胞病變，能吸附一些動(dòng)物的紅細(xì)胞。能凝集紅細(xì)胞的病毒，一般具有血吸附作用。也有些例外，如部分腸道病毒有血凝作用但無血吸附現(xiàn)象；相反非洲豬瘟病毒雖不顯示血凝活性，但卻有血吸附作用。26目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（六）干擾素敏感試驗(yàn)干擾素是具有高度生物活性的細(xì)胞產(chǎn)物，能促使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒的增殖，減少細(xì)胞CPE產(chǎn)生。制備單層細(xì)胞培養(yǎng)干擾素處理細(xì)胞接種病毒結(jié)果判定對(duì)照組只加維持液4：無明顯CPE3：CPE占25%2：CPE占有50%1：CPE占100%27目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（七）蝕斑形成單位測(cè)定病毒蝕斑(又叫空斑)如同噬菌體的噬斑，一個(gè)蝕斑為一個(gè)病毒體的繁殖后代品系。在細(xì)胞培養(yǎng)中做蝕斑是一種較精確地測(cè)定病毒感染力的方法?！痉椒ā浚?、將病毒各稀釋度種入單層細(xì)胞瓶，吸附1小時(shí)后，在單層細(xì)胞上復(fù)以營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，病毒在細(xì)胞中繁殖使細(xì)胞死亡。但由于瓊脂的限制只能感染鄰近的細(xì)胞，形成“蝕斑”的退化細(xì)胞區(qū)。2、經(jīng)中性紅活細(xì)胞染料著色后，活細(xì)胞顯紅色，而蝕斑區(qū)細(xì)胞已退化不著色，形成不染色區(qū)域。3、凡是能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生細(xì)胞死亡破裂現(xiàn)象（CPE）的病毒都可采用蝕斑技術(shù)來分離和測(cè)定。

28目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（八）病毒毒力的測(cè)定衡量病毒毒力（毒價(jià)）的單位過去多用最小致死量（MLD）?，F(xiàn)多改用半數(shù)致死量（LD50）。用雞胚測(cè)定時(shí)，毒價(jià)單位為雞胚半數(shù)致死量（ELD50）或雞胚半數(shù)感染量（ELD50）。用細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定時(shí)，用組織細(xì)胞半數(shù)感染量（ELD50）。29目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)（九）血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)?zāi)承┎《荆ˋ型流感病毒、雞新城域病毒等）由于具有血凝素，可以使雞或其他一些動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。如果在這些病毒懸液中先加入特異性的免疫血清，則病毒凝集紅細(xì)胞的作用被抑制。紅細(xì)胞凝集極凝集抑制試驗(yàn)常用于測(cè)定病毒的含量及病毒的鑒定等。30目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第四節(jié)其他病原微生物分離及鑒定一、螺旋體螺旋體是一類菌體細(xì)長(zhǎng)、柔軟、彎曲呈螺旋狀，能活潑運(yùn)動(dòng)的原核單細(xì)胞微生物。基本結(jié)構(gòu)與細(xì)菌類似。從有疑似急性螺旋體病癥狀的動(dòng)物的血液和乳液中分離到螺旋體是有診斷價(jià)值的。但從血液中分離有一定難度，因?yàn)榫Y和臨床癥狀往往不是同時(shí)出現(xiàn)。（一）病料的采集與檢查（暗視野）（二）分離培養(yǎng)（三）動(dòng)物感染試驗(yàn)（四）血清學(xué)試驗(yàn)31目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)二、立克次氏體立克次氏體是介于細(xì)菌和病毒之間的一類微生物，除少數(shù)成員外，大多為嚴(yán)格的細(xì)胞寄生性微生物。革蘭氏染色陰性。微生物學(xué)診斷：病原的分離鑒定和動(dòng)物血清中特異性抗體的檢測(cè)。有些立克次氏體如Q熱立克次氏體，對(duì)人有很強(qiáng)的傳染性。在進(jìn)行有關(guān)活立克次氏體的操作實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)有完善的隔離防護(hù)設(shè)施和條件。32目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)三、支原體支原體是能在無活細(xì)胞培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物，它是一類無細(xì)胞壁，僅由三層薄膜組成的細(xì)胞膜，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀核糖體，雙股DNA的原核細(xì)胞。菌體形態(tài)呈高度多形性，有球狀、桿狀、環(huán)狀、絲狀等。革蘭氏染色陰性，但較難著色。姬母薩氏法染色良好，呈淡紫色。支原體菌落33目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)四、衣原體衣原體是一類專性嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生活的微生物，不能在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖；在光學(xué)顯微鏡下可以被觀察到。衣原體屬中與動(dòng)物有病原關(guān)系的主要為鸚鵡衣原體，它可引起畜禽的多種疾病，要確診其病原，需進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)及對(duì)分離物作鑒定。最常用的分離培養(yǎng)方法有（1）雞胚卵黃囊接種法（2）小鼠接種法（3）細(xì)胞培養(yǎng)法。34目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第五節(jié)寄生蟲檢查一、蟲卵檢查法：蟲卵漂浮法二、蟲體檢查法蠕蟲的成蟲檢查法：生前主要用于絳蟲病疹斷，死后剖檢。蠕蟲的幼蟲檢查法：多用于非腸道寄生蟲或通過蟲卵不易鑒定的寄生蟲三、免疫學(xué)檢測(cè)方法免疫沉淀法免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫凝集技術(shù)四、分子生物學(xué)檢測(cè)方法35目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)第六節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用在動(dòng)物疫病診斷和檢疫中，現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩方面：一是基于抗原抗體反應(yīng)的免疫血清學(xué)技術(shù)；二是基于病原核酸檢測(cè)分子生物學(xué)技術(shù)。36目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點(diǎn)免疫血清學(xué)技術(shù)包括：中和試驗(yàn)：分離的病毒用已知特異性免疫血清來中和。凝集試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)免疫熒光抗體技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)

禽流感新城疫病毒膠體金快速診斷試紙的使用免疫電鏡技術(shù)等病原菌的檢測(cè)毒素的檢測(cè)