實(shí)驗(yàn)報(bào)告-不同因素對(duì)酶的影響

專(zhuān)業(yè)：姓名：學(xué)號(hào)：專(zhuān)業(yè)：姓名：學(xué)號(hào)：日期：地點(diǎn)：裝訂線生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）酶的基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）酶的基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)——底物專(zhuān)一性劑、激活劑和抑制、最適溫度課程名稱(chēng)：指導(dǎo)老師：成績(jī)：實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：分離鑒定實(shí)驗(yàn)同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（必填）四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得Ⅰ.酶的基本性質(zhì)——底物專(zhuān)一性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.了解酶的專(zhuān)一性。2.掌握驗(yàn)證酶的專(zhuān)一性的基本原理及方法。3.學(xué)會(huì)排除干擾因素，設(shè)計(jì)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)基本原理 酶是一種具有催化功能的蛋白質(zhì)。酶蛋白結(jié)構(gòu)決定了酶的功能——酶的高效性，酶催化的反應(yīng)（酶促反應(yīng)）要比相應(yīng)的沒(méi)有催化劑的反應(yīng)快103-1017倍。酶催化作用的一個(gè)重要特點(diǎn)是具有高度的底物專(zhuān)一性，即一種酶只能對(duì)某一種底物或一類(lèi)底物起催化作用，對(duì)其他底物無(wú)催化反應(yīng)。根據(jù)各種酶對(duì)底物的選擇程度不同，它們的專(zhuān)一性可以分為下列幾種：1.相對(duì)專(zhuān)一性一種酶能夠催化一類(lèi)具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行某種類(lèi)型的反應(yīng)。2.絕對(duì)專(zhuān)一性：有些酶對(duì)底物的要求非常嚴(yán)格只作用于一種底物，而不作用于任何其他物質(zhì)。如脲酶只能催化尿素進(jìn)行水解而生成二氧化碳和氨。如麥芽糖酶只作用于麥芽糖而不作用其它雙糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纖維素。3.立體異構(gòu)專(zhuān)一性有些酶只有作用于底物的立體異構(gòu)物中的一種，而對(duì)另一種則全無(wú)作用。如酵母中的糖酶類(lèi)只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶、蔗糖酶對(duì)淀粉、蔗糖水解反應(yīng)的催化作用來(lái)觀察酶的專(zhuān)一性。采用Benedict試劑檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。Benedict試劑是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性糖的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成磚紅色氧化亞銅沉淀。Na2CO3+2H2O2NaOH+H2CO3CuSO4+2NaOHCu(OH)2+Na2SO4還原糖(—CHOor—C=O)+2Cu(OH)2Cu2O(磚紅色或黃色)+2H2O+糖的氧化產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)上，淀粉幾乎沒(méi)有，而蔗糖、棉子糖全無(wú)半縮醛基，它們均無(wú)還原性，因此它們與Benedict試劑無(wú)呈色反應(yīng)。淀粉被淀粉酶水解，產(chǎn)物為葡萄糖；蔗糖和棉子糖被蔗糖酶水解，其產(chǎn)物為果糖和葡萄糖，它們都為具有自由半縮醛羥基的還原糖，與Benedict試劑共熱，即產(chǎn)生紅棕色Cu2O沉淀。本實(shí)驗(yàn)以此顏色反應(yīng)觀察淀粉酶、蔗糖酶對(duì)淀粉和蔗糖的水解作用。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料⑴蔗糖酶(樣品Ⅳ）；⑵新鮮唾液（含唾液淀粉酶）；2、實(shí)驗(yàn)試劑⑴蔗糖酶液蔗糖酶液(樣品Ⅳ）加蒸餾水適當(dāng)稀釋?zhuān)瑐溆?；⑵唾液淀粉酶液（學(xué)生自制）取0.5mL唾液至25ml量筒中，用蒸餾水（稀釋?zhuān)┑?5ml，用棉花過(guò)濾備用。唾液稀倍數(shù)因人而異，可稀釋50～400倍，甚至更高；⑶5%蔗糖（A.R.）溶液；⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；⑸Benedict試劑；四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1.漏斗，2.脫脂棉花；3.恒溫水?。?7℃，100℃）；4.量筒；5.試管；6.燒杯；7.吸量管。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟㈠檢查試劑取3支試管，按下表操作：注：1、檢查目的：試劑是否有干擾因素存在。2、也可對(duì)蔗糖酶液、唾液淀粉酶液進(jìn)行檢查是否也有干擾因素存在，請(qǐng)自己設(shè)計(jì)。㈡淀粉酶的專(zhuān)一性

取三支試管，按下表操作：注：可增加一組唾液淀粉酶液經(jīng)100℃加熱3min處理后的樣品對(duì)照組。㈢蔗糖酶的專(zhuān)一性取三支試管，按下表操作：注：可增加一組蔗糖酶液經(jīng)100℃加熱3min處理后的樣品對(duì)照組。六、結(jié)果分析討論 各試管觀察結(jié)果依次是：（一）：1號(hào)藍(lán)綠色，2號(hào)藍(lán)色，3號(hào)藍(lán)色反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（3）碘化鉀–碘液不要過(guò)早地加到點(diǎn)滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。六、結(jié)果分析討論1號(hào)試管為藍(lán)紫色，2號(hào)為淺黃色，3號(hào)為褐色，4號(hào)為淺褐色。試管1中顏色最深，說(shuō)明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；試管2中顏色最淺，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，說(shuō)明NaCl可以激活淀粉酶的活性；試管3、4中顏色基本一致，且深淺居于試管1、2之間，淀粉酶活性一般，說(shuō)明Na+、SO42-對(duì)淀粉酶活性都沒(méi)有影響。故總體上看，可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活劑，Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑。七、思考題1.激活劑可分哪幾類(lèi)？本實(shí)驗(yàn)中NaCl、硫酸銅是屬于哪種類(lèi)型？激活劑可分為：簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)離子、中等大小有機(jī)分子、能除去抑制劑的物質(zhì)、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)等。NaCl屬于簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)離子；CuSO4屬于重金屬抑制劑。2.本實(shí)驗(yàn)中，1，2，3，4管各有何用意？為什么要設(shè)計(jì)第3管和第4管？1管可觀察抑制劑對(duì)反應(yīng)影響的現(xiàn)象，2管可觀察激活劑對(duì)反應(yīng)影響的現(xiàn)象，第3管可以將1管中的Na+和2管中的SO42-對(duì)反應(yīng)的影響去除，4管作為空白對(duì)照。3.抑制劑與變性劑有何不同？試舉例說(shuō)明。抑制劑只改變酶的催化活性，并不使蛋白質(zhì)變性，其影響是可逆的；變性劑破壞了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，并且多數(shù)變性劑的影響是不可逆的。如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑，但如果將Cu2+去除淀粉酶的活性又可以變?yōu)檎Ｋ?。八、注意事?xiàng)1.試管要干凈，所有試劑加量準(zhǔn)確，加好試劑后要搖勻。2.使用試劑時(shí)不要人為造成試劑間的互相污染，以免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤。3.試劑用好瓶蓋要立即蓋好，防止試劑間的互相污染。4.兩種淀粉不要弄錯(cuò)。5.激活劑抑制劑實(shí)驗(yàn)中，注意運(yùn)用點(diǎn)滴板（顯色板）來(lái)控制保溫時(shí)間；如1，2，3，4管顏色反應(yīng)無(wú)明顯差別，可能是唾流淀粉酶活力太高或太低，若酶活性太高可將酶稀釋后重做；若酶活性太低，可延長(zhǎng)保溫時(shí)間或增加酶的濃度。Ⅲ.影響酶活性的因素——溫度，最適溫度測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.了解溫度對(duì)酶活力的影響；2.學(xué)習(xí)測(cè)定最適溫度的原理和方法；二、實(shí)驗(yàn)基本原理 酶的催化反應(yīng)受溫度影響很大，每一種酶所催化的反應(yīng)，在一定條件下，僅在某一溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的活力，即反應(yīng)速度最大時(shí)的溫度，這個(gè)溫度稱(chēng)為該酶促反應(yīng)的最適溫度，高于或低于最適溫度時(shí)，反應(yīng)速度逐漸下降。因此，酶促反應(yīng)與溫度的關(guān)系，用酶活力對(duì)溫度作圖，通常具有鐘罩形曲線特征。溫度與酶活力的關(guān)系測(cè)定是選擇一定的條件，把底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間、pH等固定在最適狀態(tài)下，然后在一系列不同溫度條件下，進(jìn)行反應(yīng)初速度測(cè)定，以酶反應(yīng)初速度對(duì)溫度作圖，可以得一個(gè)鐘罩形的曲線，即為溫度—酶活性曲線，在某溫度有一酶活力最大值，這個(gè)溫度即為最適溫度。實(shí)驗(yàn)①利用唾液淀粉酶為試驗(yàn)對(duì)象，在0℃～65℃之間選擇不同的溫度，進(jìn)行酶活力測(cè)定。根據(jù)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈現(xiàn)顏色的變化來(lái)判斷酶活力的大小及最適溫度。實(shí)驗(yàn)②采用蔗糖酶為試驗(yàn)對(duì)象，在室溫至75℃之間選擇不同溫度進(jìn)行酶活力測(cè)定。蔗糖酶的活力常以其反應(yīng)產(chǎn)物還原糖（葡萄糖）的生成量來(lái)表示。測(cè)定還原糖的方法很多，本實(shí)驗(yàn)選擇3,5–二硝基水揚(yáng)酸法測(cè)定還原糖量。在堿性條件下，3,5–二硝水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成紅色氨基化合物，并在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)溶液所呈棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度成正比。因此，可以用分光光度法測(cè)定酶促反應(yīng)后生成的還原糖量，從而測(cè)定蔗糖水解的速度和酶活力。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料⑴蔗糖酶液(樣品Ⅳ）加蒸餾水適當(dāng)稀釋?zhuān)瑐溆茫虎菩迈r唾液。2、實(shí)驗(yàn)試劑⑴0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）⑵5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）⑶3,5—二硝基水揚(yáng)酸（簡(jiǎn)稱(chēng)DNS）試劑⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）⑸KI-I2溶液四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1.試管及試管架，2．恒溫水浴，3．吸量管,4．滴管,5．點(diǎn)滴板，6．分光光度計(jì)，7．制冰機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟一、溫度對(duì)唾液淀粉酶活力的影響1．觀察溫度對(duì)酶活動(dòng)的影響：取5支試管，按下表操作。注意：⑴找出準(zhǔn)確的保溫時(shí)間，是本實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個(gè)人情況而定，通過(guò)37℃水浴溶保溫計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間最好在8～15min以?xún)?nèi)，只有確定準(zhǔn)確的保溫時(shí)間才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）加入酶液后，務(wù)必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（3）碘化鉀–碘液不要過(guò)早地加到點(diǎn)滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。⑷各管保溫時(shí)間要相同。2、繪制溫度-酶活力曲線圖，以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液顏色的深淺程度（代表酶活力的大?。榭v坐標(biāo)。繪制溫度——酶活力曲線（鐘罩形），確定唾液淀粉酶的最適溫度。二、溫度對(duì)蔗糖酶活力的影響1、蔗糖酶最適溫度的測(cè)定取試管7支進(jìn)行編號(hào)，0號(hào)管為空白對(duì)照，以蒸餾水代替酶液，1—7號(hào)順序?yàn)闇y(cè)定管，向各管加入0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）1ml，2%蔗糖溶液0.5ml，然后將各編號(hào)管依次放入相應(yīng)溫度（見(jiàn)下表）的恒溫水浴或恒溫箱中，預(yù)熱2min，再逐管準(zhǔn)確計(jì)時(shí)加入0.5ml經(jīng)適當(dāng)稀釋的蔗糖酶液，迅速混勻；精確反應(yīng)10min后，加入1ml3,5–二硝基水楊酸（DNS）試劑，立即混勻，放入沸水浴中加熱5min。取出用流水冷卻至室溫后，向各管加入5ml蒸餾水，充分混勻。以0號(hào)管作空白對(duì)照A520值為零，在分光光度計(jì)上于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的A520值，并作好記錄。2、繪制溫度——酶的活力曲線圖以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A520（表示反應(yīng)初速度）為縱坐標(biāo)，繪制出溫度—酶活力（A520值）曲線圖，從而可以測(cè)出蔗糖酶在本實(shí)驗(yàn)條件下的最適溫度。六、結(jié)果分析討論（一）溫度對(duì)唾液淀粉酶活力的影響1至5號(hào)試管顏色依次為藍(lán)紫色、淺黃色、黃色、淺黃色、紅棕色當(dāng)溫度為37℃時(shí)淀粉水解最完全，唾液淀粉酶的活性最高；在37℃兩邊唾液淀粉酶的活性都隨著溫度的改變而降低，故本組實(shí)驗(yàn)的唾液淀粉酶的最適溫度在37℃左右。唾液淀粉酶的活性應(yīng)該是在正常的人體體溫37℃時(shí)最適。（二）溫度對(duì)蔗糖酶活力的影響0至5號(hào)試管分光度依次為0，0.726，1.155，1.388，0.501，0.218最佳溫度在48℃左右。由試劑在520nm波長(zhǎng)的吸光度對(duì)溫度作圖得到如上圖的A520-T曲線。由圖線看出蔗糖酶在48℃時(shí)活性最高，故蔗糖酶的最適溫度為48℃。同時(shí)由曲線看出溫度高于65℃后酶活性顯著下降，這是因?yàn)榇藭r(shí)酶已經(jīng)因?yàn)楦邷匕l(fā)生了變性，失去了大部分的催化活性，故催化能力大大減弱。七、思考題1．什么是酶的最適溫度？有何用途？答：酶的最適溫度是酶促反應(yīng)在速率最大時(shí)的溫度。在最適溫度下，酶的催化活性最高，此時(shí)