親合組織化學(xué)技術(shù)

親合組織化學(xué)技術(shù)第一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五發(fā)展歷史60年代：發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素70年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC…親和組織化學(xué)：1976年Bayer首次提出包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白與IgG、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作用部位和受體等第二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五植物凝集素(Lectin)生物素(Biotin)葡萄球菌A蛋白(SPA)SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。親合組織化學(xué)技術(shù)定義：是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)，建立的組織細胞基礎(chǔ)化學(xué)技術(shù)。本質(zhì)：區(qū)別于一般的組織化學(xué)，非抗原抗體反應(yīng)。優(yōu)點：敏感性高，有利于微量抗原（或抗體）在細胞或亞細胞水平的定位。第三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五一抗生物素—生物素免疫細胞化學(xué)技術(shù)

二葡萄球菌蛋白A技術(shù)

三凝集素組織化學(xué)技術(shù)四其它親和細胞化學(xué)第四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五一、抗生物素—生物素免疫細胞化學(xué)技術(shù)

(一)基本原理

親合素（抗生物素/卵白素）是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白，屬于糖蛋白;具有4個同維生素H(生物素)親合力極高的結(jié)合點。

鏈酶親合素

是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親合素一樣，也有四個生物素結(jié)合位點，是一種親和力更高的生物素結(jié)合蛋白。生物素（維生素H）是一種小分子的水溶性維生素，它與親合素／鏈酶親合素之間有很強的親合力，較之抗體對抗原的親合力要高出100萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性?！?/p>

生物素、親合素、鏈酶親合素：能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合。★

親合素、鏈酶親合素：同一定濃度的生物素化酶混合后，形成親合素一生物素一酶復(fù)合物。這種復(fù)合物可以和各種生物素標記抗體結(jié)合。第五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五（二）幾種親合素—生物素染色技術(shù)

1親合素一生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)2．鏈酶親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)3．標記生物素—抗生物素技術(shù)(LAB)4.SP/SAP法5.Envision法6.CSA法第六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五ABC復(fù)合物：親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物1親合素一生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)第七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五⑴基本原理

是將親合素作為“橋”與生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶（HRP)連接起來。

第一抗體：為未標記特異性抗體，能結(jié)合組織中待測抗原；第二抗體：為生物素化的橋抗體，能與第一抗體結(jié)合；

第三抗體：是結(jié)合了過氧化物酶的親合素復(fù)合物(即ABC)。優(yōu)點：敏感性強（比PAP高20-40倍）；特異性強，背景染色淡；方法簡便，節(jié)約時間（比PAP縮短2h）

；由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。第八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五⑵操作步驟①冰凍切片或石蠟切片均可。②冰凍切片：丙酮固定，PBS洗5min，更換3次。石蠟切片：脫蠟，系列酒精至水。③第一抗體孵育，過夜。④PBS洗5min，更換3次。⑤加生物素標記的第二抗體，孵育15min。

⑥PBS洗5min，更換3次。⑦加ABC復(fù)合物室溫作用15min。⑧PBS洗5min，更換3次。⑨用DAB顯色。⑩復(fù)染、封片、觀察。⑶結(jié)果

呈棕黃色為陽性表達，核被蘇木精染成淺藍色。第九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五(4)注意事項

①消除內(nèi)源性生物素：染色前以0.01％的親合素和0.01％生物素溶液分別作用20min以消除內(nèi)源性生物素活性，每次作用后用PBS漂洗3次，5min。②消除內(nèi)源性過氧化物酶：可用3％H2O2孵育5-10分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水洗3次。③試劑的保存：溫度以4℃為佳，可達2年之久，在－20℃時其生物活性反而在短期內(nèi)被破壞。

此外，生物素制劑之間相互親和性差異大，注意廠家和批號。第十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五SABC法原理：一抗＋生物素化二抗＋SABC復(fù)合物SABC復(fù)合物鏈霉卵白素－生物素－過氧化物酶生物素標記的二抗鏈霉卵白素連接生物素標記的酶。優(yōu)點：敏感性略高于SP法，低背景和操作簡便缺點：因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素，易產(chǎn)生非特異性染色。

一抗+生物素標記二抗+滴加試劑SABC（鏈霉卵白素+辣根酶標記生物素)+辣根酶底物顯色

2鏈酶親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)第十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五SABC試劑盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等)操作程序1）載玻片防脫處理：可選擇APES或Poly—Lysine，烤片。2）切片常規(guī)脫蠟至水。3）3％H202滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。4）抗原熱修復(fù)：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0)，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5—10分鐘后，反復(fù)1—2次。冷卻后PBS洗滌。5）滴加5％BSA封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，不洗。6）滴加適當稀釋的一抗，37℃1小時左右或20℃2小時左右。也可4℃過夜。PBS(pH7.2—7.6)洗2分鐘×3次。對照切片用PBS代替一抗。第十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五7）滴加生物素化二抗，20—37℃20分鐘。PBS(pH7.2—7.6)洗2分鐘×3次。8）滴加試劑SABC，20—37℃20分鐘。PBS(pH7.2—7.6)洗5分鐘×4次。9）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5一30分鐘之間。蒸餾水洗滌。10）蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。結(jié)果

棕褐色為陽性結(jié)果，而細胞核染為淡藍色。第十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五

注意事項

1）染色背景過高：

在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前，用加有0.0l一0.02％TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后DAB顯色。

2）抗原熱修復(fù)：可選0.01M枸櫞酸鹽緩沖液；也可以使用PBS、TBS等多種緩沖液。第十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五3標記生物素—抗生物素技術(shù)(LAB)原理：

第—抗體：生物素標記；

第二抗體：酶標記抗生物素(親合素)操作步驟：

⑴切片中加入生物素標記一抗，室溫孵育1h，。⑵0.01MPBS洗3次，每次5min。⑶20-50ug／mlHRP-抗生物素液孵育。0.01MPBS漂洗3次。⑷DAB顯色。蒸餾水漂洗。⑸蘇木精復(fù)染核。梯度乙醇脫水、透明、封片、鏡檢。

應(yīng)用不如ABC普遍，但手續(xù)較簡便，但靈敏度低。第十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五SP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白素/過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色）

原理：一抗＋生物素化二抗＋酶標記的鏈霉卵白素優(yōu)點：高靈敏度、低背景、操作方便缺點：不適用于內(nèi)源性生物素豐富的組織

第十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五三步法（以SP試劑盒為例）

?

石蠟切片脫蠟至水。

?

蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進行。

?3%H2O2室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。

?5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小時或4℃過夜。

?PBS沖洗，2分鐘×3次。

?

滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10-30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10-20分鐘。

?PBS沖洗，2分鐘×3次。

?

滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10-30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10-20分鐘。

?PBS沖洗，2分鐘×3次。

?

顯色劑顯色（DAB或AEC）。

?

自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明（如需要）、封片。第十七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五原理：將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體

優(yōu)點：1簡便、快速、敏感性是SP、SABC法的幾十倍。2人體組織中不含有這種多聚物，從而避免了組織中生物素的干擾缺點：因大分子穿透核膜困難,對于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。Envision法一抗+二抗標記多聚螯合物酶Envision法第十八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五EnVision工作程序：

1）脫蠟、水化組織切片。

2）預(yù)處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）

3）蒸餾水漂洗，置于PBS中。

4）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTM/HRP）

5）蒸餾水漂洗，置于PBS，10分鐘

6）一抗孵育10-30分鐘

7）PBS漂洗10分鐘

8）EnVisionTM孵育10-30分鐘

9）PBS漂洗10分鐘

10)色源底物溶液孵育10分鐘

11)蒸餾水漂洗

12)復(fù)染及封片第十九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五CSA法（催化信號放大法）原理：是酪胺的過氧化物酶反應(yīng)(即HRP催化酪胺鹽，形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原—抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的鏈霉親和素—HRP結(jié)合，如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以網(wǎng)絡(luò)許許多多的酶分子，最后通過DAB的顯色反應(yīng)，其敏感性得到幾何級放大。優(yōu)點：比EnVision法敏感20～100倍。適合于實驗病理學(xué)和第一抗體昂貴、抗原性較弱的IHC檢測以及抗原破壞嚴重、抗原量較少的組織細胞抗原的檢測方法;核內(nèi)抗原的檢測（原為雜交）。缺點：操作步驟多、孵育時間長，存在嚴重的內(nèi)源性干擾，背景染色有時較重。第二十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五二、葡萄球菌蛋白A技術(shù)

葡萄球菌蛋白A(SPA)：

金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)，作為橋抗體或標記抗體不受種屬特異性的限制，它能和人及許多動物IgG結(jié)合，對IgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性。

葡萄球菌蛋白A(SPA)技術(shù)原理：結(jié)合部位是Fc段，不影響抗體的活性；結(jié)合力是雙價的，可同時結(jié)合兩個IgG分子；可將酶、熒光素、膠體金等標記在SPA上。第二十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五SPA應(yīng)用:

1免疫球蛋白的制備和分析

能和IgG及其某些Fc段結(jié)合，可提純、分析免疫球蛋白制劑。

2應(yīng)用于免疫細胞化學(xué)

結(jié)合力是雙價的，可作為橋抗體或標記抗體。且不受種屬特異性限制；

分子量小，穿透力強。

3應(yīng)用于多種細菌、支原體和病毒的簡易快速診斷

SPA菌體為載體，結(jié)合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集素，用于細菌、病毒的定群和分型。

4可作為固相吸附劑研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜Ig

第二十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五SPA在免疫細胞化學(xué)染色中的應(yīng)用SPA可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標記，其中最常用的酶為HRP1SPA-HRP用于間接法的染色

(1)切片脫蠟至水，3％H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。

(2)水洗后，PBS漂洗。

(3)加一抗，37℃孵育60min或4℃過夜。0.01MPBS漂洗3次。

(4)SPA-HRP室溫30min。0.01MPBS漂洗3次。

(5)DAB顯色。

(6)蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。第二十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五2SPA用于PAP法的染色

(1)切片脫蠟至水，0.3％H202甲醇處理切片。

(2)10％卵蛋白Tris緩沖液處理20min。

(3)加第一抗體37℃孵育60min或4℃過夜。

(4)0.05MTris-HCl，pH7.6，洗滌3次。

(5)SPA(1ug／m1)孵育15min，0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。

(6)PAP復(fù)合物(無動物種屬限制)孵育15min。0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。（抗酶抗體+足量的酶==形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物）

(7)DAB顯色。

(8)蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。第二十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五三、凝集素組織化學(xué)技術(shù)凝集素(1ectin)：從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，能凝集紅細胞。常用：刀豆素(ConA)、麥胚素(WGA)、花生凝集素(PNA)、