細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件 激光共聚焦顯微鏡的實(shí)例

第四部分

激光共聚焦顯微鏡

在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中的應(yīng)用

常用于生物細(xì)胞或組織內(nèi)的分子原位鑒定和定量，細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察；以及活體細(xì)胞或組織功能的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在生命科學(xué)領(lǐng)域的分子水平，細(xì)胞及組織水平的研究中得到廣泛應(yīng)用。一、靜態(tài)觀測(cè)--高分辨率、亞細(xì)胞水平、多重標(biāo)記原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子，觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)二、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)激光共聚焦顯微鏡

在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中的應(yīng)用三、蛋白分子直接相互作用檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞器線粒體，MitotrackerGreenFM（490/516）高爾基體，NBDC6-ceramie（466/536）細(xì)胞核，DAPI（358/461)溶酶體（555/584）一、靜態(tài)觀測(cè)熒光染料直接染色MolecularProbes?手冊(cè)，電子顯微鏡觀察到的細(xì)胞器共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡的區(qū)別線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體激光共聚焦顯微鏡電子顯微鏡工作原理光波的透射電子的透射成像效果分辨率微米級(jí)納米級(jí)標(biāo)記物多色熒光素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察分布、表達(dá)量觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)溶酶體觀察細(xì)胞形態(tài)原代培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞一、靜態(tài)觀測(cè)觀察細(xì)胞形態(tài)

蛋白分子與血管的關(guān)系檢測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位及多重?zé)晒鈽?biāo)記

一、靜態(tài)觀測(cè)五彩繽紛“腦彩虹”上的神經(jīng)元回路檢測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位及多重?zé)晒鈽?biāo)記

能夠追蹤神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)中的活動(dòng)，從而獲得對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的組織和功能的新理解。Nature

450,56-62Cre/lox基因系統(tǒng)一、靜態(tài)觀測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡常用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法：

細(xì)胞核形態(tài)觀察法；TUNEL法；AnnexinV/PI雙染法1、細(xì)胞核形態(tài)觀察法常用染料：DAPI，PI，HoechstⅠ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體對(duì)照II期bII期aI期一、靜態(tài)觀測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡2、凋亡早期檢測(cè)--磷脂酰絲氨酸：AnnexinV/PI雙染法凋亡磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移一、靜態(tài)觀測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡3、TUNEL法（脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）TUNEL+DAPITUNEL一、靜態(tài)觀測(cè)二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光物質(zhì)的觀測(cè)離子濃度變化趨勢(shì)的檢測(cè)分子運(yùn)動(dòng)的測(cè)量急性分離心肌細(xì)胞在KCL作用下的胞內(nèi)鈣的變化培養(yǎng)/分離的細(xì)胞清洗、換液20uMFluo3-AM負(fù)載液30-60min掃描二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)常用熒光染料：Fluor-3AMKCl心肌細(xì)胞中的鈣火花—線掃描功能，最快的XYT二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)的檢測(cè)二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)con5min30min60min90min10min405488mergeEBSS:HEPG2hyper3探針488/405越高越氧化熒光漂白的測(cè)量常用熒光分子：GFP（綠色熒光蛋白）

基本原理：

使用強(qiáng)激光照射，將細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)區(qū)域內(nèi)的熒光分子漂白，然后觀察未漂白的熒光分子的運(yùn)動(dòng)。分類：熒光漂白恢復(fù)（FRAP）實(shí)驗(yàn)熒光漂白丟失（FLIP）實(shí)驗(yàn)

二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Figure10-36aMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量細(xì)胞間通訊細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交流細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Figure10-36bMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)熒光漂白丟失（FLIP）實(shí)驗(yàn)研究GFP融合的蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器內(nèi)的分布等。二、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)三、蛋白分子間相互作用的研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）GFP在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

研究蛋白相互作用方法之一熒光共振能量轉(zhuǎn)移（

FRET）三、蛋白分子間相互作用的研究原理1、供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于30%2、供體分子和受體分子的距離必須在1-10nm之間3.供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩和受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及他們的向量必須滿足一定的條件發(fā)生FRET需要三個(gè)條件：常用的熒光分子對(duì)：FITC-Rhodamine,Alexa488-Cy3，Cy3-Cy5，BFP-GFP，BFP-YFP，CFP-YFP，CFP-dsRED三、蛋白分子間相互作用的研究研究蛋白相互作用方法之一熒光共振能量轉(zhuǎn)移（

FRET）檢測(cè)FRET的方法一：受體分子漂白法（AcceptorPhotoBleaching）—僅適用于固定標(biāo)本當(dāng)FRET發(fā)生時(shí)，因?yàn)楣w分子的激發(fā)態(tài)能量被轉(zhuǎn)移到了受體分子，所以供體分子的熒光會(huì)受到淬滅。如果選擇性的光漂白受體分子，那么就可以去除FRET并增加供體分子的熒光信號(hào)，在實(shí)驗(yàn)中這種方法被稱為受體分子漂白法。EF=(Iafter–Ibefore)/Iafter

三、蛋白分子間相互作用的研究研究蛋白相互作用方法之一熒光共振能量轉(zhuǎn)移（

FRET）

供體（HIF1-α）Merge

受體（P300）受體漂白前受體漂白后受體漂白前受體漂白后受體漂白前受體漂白后（a）（b）（c）圖

漂白前后供體和受體熒光圖像CoCl2處理組，受體熒光漂白后，供體熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)，而（b）2umol/LX蛋白（c）10umol/LX蛋白預(yù)處理組細(xì)胞受體熒光漂白后，供體熒光強(qiáng)度基本沒有明顯變化。Figcellimagesfromacceptorphotobleachingexperiments(a)CoCl2treatedcells(b)2umol/LSK17treatedcells(c)10umol/LSK17treatedcells檢測(cè)FRET的方法二：直接測(cè)量接受分子的熒光強(qiáng)度變化（SensitizedEmission）—適用于固定標(biāo)本和活細(xì)胞為了去除串色的影響，需要采集不同標(biāo)本的圖片：①這些標(biāo)本包括：只有供體分子的標(biāo)本、只有受體分子的標(biāo)本、和共表達(dá)了供體分子和受體分子的標(biāo)本。②另外，還需要分別使用供體分子的激發(fā)光和受體分子的激發(fā)光來激發(fā)，在供體分子通道和受體分子通道測(cè)量熒光，并且保持儀器的參數(shù)不變。三、蛋白分子間相互作用的研究研究蛋白相互作用方法之一熒光共振能量轉(zhuǎn)移（

FRET）研究蛋白相互作用方法之二以分離的EGFP為報(bào)告系統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)在以EGFP為報(bào)告基因的酵母雙雜交系統(tǒng)中，當(dāng)誘餌蛋白與靶蛋白相互作用時(shí)，被分開的EGFP就會(huì)重建，其原有的熒光特性得以恢復(fù)，而且能夠快速直接地監(jiān)測(cè)到這種相互作用。

三、蛋白分子間相互作用的研究三、蛋白分子間相互作用的研究研究蛋白相互作用方法之二以分離的EGFP為報(bào)告系統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)該系統(tǒng)有三方面的優(yōu)勢(shì)：

第一，EGFP報(bào)告基因既不需要外源底物也不需要任何輔助因子；

第二，該系統(tǒng)采用低拷貝數(shù)質(zhì)粒，減少了細(xì)胞毒性；

第三，這些轉(zhuǎn)錄因子可被用作誘餌蛋白。

ASplitEnhancedGreenFluorescentProtein-BasedReporterinYeastTwo-HybridSystem超越分辨率極限的成像技術(shù)

超高分辨率顯微鏡技術(shù)

（Super-resolutionmicroscopy）超越分辨率極限的成像技術(shù)

超高分辨率顯微鏡技術(shù)

（Super-resolutionmicroscopy）2008年以來，科學(xué)家們的技術(shù)競賽相繼開發(fā)了STED、SIM、PLAM、STORM等技術(shù)，可以通過光學(xué)顯微鏡，觀察到納米世界。超高分辨率技術(shù)不同方法之間的比較Super-resolutionmicroscopy:

breakingthelimits由共聚焦顯微鏡（左圖）和STED（右圖）成像的一個(gè)神經(jīng)元。通過3DSTORM觀察到的一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)狀系統(tǒng)。傳統(tǒng)熒光成像（左圖）；3DSTORM成像（中圖），其中，采用不同顏色標(biāo)記出z的位置；3D

STORM成像中xy維圖像（右圖）。Super-resolutionmicroscopy:

breakingthelimits果蠅卵母細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白的3D

SIM成像，該照片拍攝于完整的卵泡內(nèi)。

PALM在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)拍攝到的粘附復(fù)