早期給予紅花注射液對大鼠腦出血后血腫周圍細(xì)胞凋亡的影響

早期給予紅花注射液對大鼠腦出血后血腫周圍細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的探討大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后早期不同時(shí)間注射紅花注射液后，對血腫周圍細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白等指標(biāo)的影響。方法將96只SD大鼠隨機(jī)分成紅花治療組、出血對照組、正常對照組，各組又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治療組。各組均于腦出血后第72h處死，取腦，連續(xù)切片做TUNEL染色和免疫組化染色。觀察不同時(shí)間用藥對大鼠神經(jīng)功能評分、血腫周圍細(xì)胞凋亡數(shù)目及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2/Bax等指標(biāo)的影響。結(jié)果與出血對照組相比較，各藥物治療組的神經(jīng)功能評分降低、Bcl-2/Bax蛋白比值增高、Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)減少、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少；紅花注射液組在腦出血前24h和腦出血后0h給藥治療的Bcl-2/Bax蛋白比值低于腦出血后6、12、24h治療組、Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)高于腦出血后6、12、24h治療組；在大鼠腦出血后6h、12h、24h注射紅花注射液，出血灶周圍Caspase-3陽性細(xì)胞逐漸增多、Bcl-2/Bax比值逐漸降低，出血后6h給藥治療組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)低于出血后24h治療組。結(jié)論在不同時(shí)間給予紅花注射液治療腦出血大鼠，均能不同程度地促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其中術(shù)后6h給藥組治療效果最好，其可能通過促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制血腫周圍的細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】腦出血；細(xì)胞凋亡；紅花注射液；大鼠

TheeffectofSafflorinjectiononcellapoptosisaroundthehematomaintheearlytimeafterexperimentalintracerebralhemorrhageinrats

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofSafflorinjectiononapoptoticcellandproteinaboutapoptoticcellintheearlytimeafterexperimentalintracerebralhemorrhagein96ratswererandomlydividedintotheremedialgroupwithICHandthecontrastgroupincludingICHcontrastgroupwithICHandnormalcontrastgroupwithoutICH.Theneachgroupofratsweredividedintofivegroupswhichwere24hoursremedialgroupbeforeICHofrats,0,6,12and24hoursremedialgroupafterICHofrats.Allratsinvolvedintheexperimentwerekilledonthe72ndhourfollowingICH.Theimmunohistochemicalmethodwasperformedinratbrainbyusingantibodycaspase-3orantibodybcl-2,bax.TUNELmethodwasusedtodetectapoptosisaroundtheComparedwithICHmodelgroup,Safflorinjectioncouldsignificantlyalleviateneurologicalsystemdamagesymptoms,heightentheratioofbcl-2/bax,andreducethenumberofcaspase-3positivecellandthenumberofTUNELpositivecellaroundhematomainICHrats.Thenumberofcaspase-3positivecellofSafflorgrouptreatedbeforeICH24hoursahead,afterICH0hourweremorethanthatofSafflorgrouptreatedafterICH6,12,24hours.Thebcl-2/baxofSafflorgrouptreatedbeforeICH24hoursahead,afterICH0hourwerelowerthanthatofSafflorgrouptreatedafterICH6,12or24hours.WhenthetreatedgroupwereinjectedSafflorafterICH6,12,24hours,Thenumberofcaspase-3positivecellaroundhematomawasgraduallyincreasedandthenumberofbcl-2/baxpositivecellwasgraduallydegradedandthenumberofTUNELpositivecellofSafflorgrouptreatedafterICH6hourswerelessthanthatofSafflorgrouptreatedafterICH24hours.ConclusionsWhenSafflorinjectionisusedearliertocureICH,itcandecreasetherateofcellapoptosisandcapase-3proteinexpression,heightentheratioofbcl-2/baxaroundthehematoma,especiallyintheSafflorgrouptreatedafterICH6hours.

【Keywords】intracerebralhemorrhage;apoptosis;Safflorinjection;rat

腦出血是一種發(fā)病率、病死率和致殘率均較高的臨床常見病和多發(fā)病，迄今為止對腦出血的治療雖較以往有很大進(jìn)步，但腦出血仍具有相當(dāng)高的死亡率。近年來，部分作者應(yīng)用活血化瘀法治療急性期腦出血取得了一定的療效，但在治療的時(shí)機(jī)上，特別在早期使用活血化瘀藥治療腦出血患者尚存在較大的爭議。

1材料與方法

材料

動物SD大鼠雌雄不限，體重230～280g，由寧夏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號。

主要試劑紅花注射液，Ⅶ型膠原酶，TUNEL檢測試劑盒，Caspase-3多克隆抗體，Bcl-2、Bax單克隆抗體，DAB染色試劑盒。

方法

動物分組將大鼠隨機(jī)分成紅花治療組、出血對照組、正常對照組，各組又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治療組，各紅花治療組每日腹腔注射紅花注射液1次，劑量為/，正常對照組和出血對照組組每日腹腔注射等量生理鹽水1次。每日進(jìn)行神經(jīng)功能評分1次，各組大鼠均于腦出血后第72h處死。

腦出血大鼠模型制作根據(jù)腦立體定位圖譜于大鼠前囟后，中線右側(cè)旁開鉆孔，暴露硬腦膜。微量進(jìn)樣器吸取/μlⅦ型膠原酶和/μl肝素的混合液μl，以硬腦膜平面為零點(diǎn)，緩慢進(jìn)針，深度為，緩慢注入藥物，注射完畢后留針10min，緩慢退出微量進(jìn)樣器，清潔傷口，縫合頭皮，術(shù)后保溫。

免疫組織化學(xué)染色石蠟切片，采用SP法，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察。于200倍光鏡下在血腫周圍按順時(shí)針方向在2、4、6、8、10、12六個(gè)時(shí)鐘點(diǎn)中選擇5個(gè)不重復(fù)視野區(qū)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

細(xì)胞凋亡的檢測取與免疫組化染色相鄰切片,用末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DUTP缺口末端標(biāo)記法，DAB顯色。于200倍光鏡下在血腫周圍按順時(shí)針方向在2、4、6、8、10、12六個(gè)時(shí)鐘點(diǎn)中選擇5個(gè)不重復(fù)視野區(qū)，計(jì)數(shù)TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用x±s表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析,顯著性水準(zhǔn)均為α=。

2結(jié)果

大鼠神經(jīng)功能缺損評分麻醉蘇醒后，模型組動物均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，根據(jù)Berderson評分標(biāo)準(zhǔn)對術(shù)后各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，各組評分情況見表1。表1腦出血后各時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)功能評分注：notes:▲，VSICHgroup

免疫組化Caspase-3蛋白表達(dá)以細(xì)胞漿或細(xì)胞核中呈棕黃色著色的顆粒為陽性細(xì)胞，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)均以細(xì)胞漿呈棕黃色著色為陽性細(xì)胞，以神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)為主，并且主要集中在血腫周圍腦組織。正常對照組也可見到較少的Caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白和Bax蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)，但Bcl-2/Bax的比值始終接近1。

TUNEL染色根據(jù)免疫組化的結(jié)果，選取差異顯著的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步做TUNEL染色，TUNEL陽性細(xì)胞以細(xì)胞膜周邊染色質(zhì)堆積染色呈棕黃色或細(xì)胞核著色呈棕黃色評判為TUNEL陽性細(xì)胞。在血腫周邊的外圍，以神經(jīng)元為主，少部分是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。ICH各組、各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞表達(dá)情況見表2、表3。表2各藥物在不同時(shí)間點(diǎn)給藥時(shí)血腫周圍Caspase-3、Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞記數(shù)注:VSICHgroup，▲,VS24hoursaheadremedialgroup,◆,VS24hoursaheadremedialgroup,★,VS0hoursremedialgroup，●,VS0hoursremedialgroup,■表3各組在術(shù)后6、24h給藥時(shí)血腫周圍TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)注：▲，VSICHgroup

3討論

腦出血是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的臨床常見病和多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國腦出血占急性腦血管病的40%～50%，是腦卒中死亡率最高的臨床類型，腦出血后30天內(nèi)病死率接近50%，許多存活者遺留明顯的神經(jīng)功能缺失。在治療上目前臨床上除運(yùn)用傳統(tǒng)脫水藥、手術(shù)清除血腫外，治療手段較少，無其他特效的方法［1］，且相當(dāng)部分腦出血患者雖早期行血腫清除，但預(yù)后仍然不佳。千百年來中醫(yī)中藥在腦卒中的治療得以廣泛的應(yīng)用，部分作者應(yīng)用活血化瘀法治療急性期腦出血取得了一定的療效，但在治療的時(shí)機(jī)上特別在早期使用活血化瘀藥治療腦出血患者尚存在較大的爭議。

文獻(xiàn)表明，細(xì)胞凋亡是腦出血后細(xì)胞死亡主要途徑之一［2］。各種動物實(shí)驗(yàn)表明，腦出血后4～6h細(xì)胞凋亡即開始出現(xiàn)，凋亡高峰在腦出血后48～72h［3］。另外，有研究表明：腦細(xì)胞缺血后先出現(xiàn)促凋亡基因表達(dá)，后出現(xiàn)神經(jīng)元群體的凋亡，這就為治療提供了時(shí)間窗，從理論上推測如果能在發(fā)病早期抑制促凋亡基因的表達(dá)或促進(jìn)抑制凋亡基因的表達(dá)，就能有效地保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

目前認(rèn)為，哺乳動物的細(xì)胞凋亡至少由兩條通路構(gòu)成，即死亡受體通路和線粒體通路，這兩條凋亡途徑不是孤立的,后期的共同途徑是Caspases的激活，其中caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞凋亡分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居核心地位［4］。線粒體在多種凋亡途徑中起到了核心作用［5］，在線粒體通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中，Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與之密切相關(guān)的基因。Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中已被發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的兩種基因，是一對在功能上相互對立的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)。Bcl-2和Bax是兩類典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，Bcl-2與bax結(jié)合成異二聚體是Bcl-2發(fā)揮抗凋亡活性所必需的［6］，Bcl-2/Bax異二聚體，可通過阻斷細(xì)胞色素C的釋放，抑制下游Caspase-3的激活，從而抑制凋亡的發(fā)生，即細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax比例決定受凋亡信號刺激細(xì)胞的最終命運(yùn)，Bcl-2/Bax值增加，細(xì)胞凋亡減少；反之，則誘發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制的啟動［7］。

腦出血后腦內(nèi)血腫，中醫(yī)認(rèn)為離經(jīng)之血即為淤血，治法也應(yīng)活血化瘀。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀是中風(fēng)的本質(zhì)，活血化瘀是治療中風(fēng)的根本大法，但在治療時(shí)機(jī)上存在較大爭議。有作者認(rèn)為活血化瘀不論在早期先驅(qū)癥狀、發(fā)作期，還是恢復(fù)期均可應(yīng)用。特別提出，在急性腦血管疾病中，控制出血不是采取止血方法，而是應(yīng)用活血止血、化瘀止血、理氣止血等法。

紅花作為一種應(yīng)用普遍的強(qiáng)活血藥，臨床廣泛應(yīng)用于腦中風(fēng)的治療?，F(xiàn)代藥理研究顯示紅花具有:擴(kuò)張血管、降低血壓［8］；抑制血小板活化因子誘發(fā)血小板聚集、釋放及血小板內(nèi)游離鈣濃度升高；抑制誘發(fā)的人中性粒細(xì)胞聚集、粘附［9,10］，提高大鼠的纖溶性［11］；抑制缺血腦線粒體膜流動性的降低、線粒體腫脹、脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和降低細(xì)胞色素氧化酶活性；抑制Ca2+過多攝入，改善線粒體呼吸功能，拮抗氧自由基［12］。

眾多的醫(yī)家使用活血化瘀藥多在腦出血的亞急性期。況時(shí)祥［13］認(rèn)為活血化瘀藥在腦出血急性期的主要作用還在于改善由出血而引發(fā)的血液循環(huán)障礙，減輕腦組織的缺血缺氧損傷，而并非消除血腫或減輕腦水腫，反對一味尋求促進(jìn)血腫清除的峻猛之藥,并指出腦出血在使用活血化瘀保持謹(jǐn)慎態(tài)度，防止再出血，認(rèn)為發(fā)病后6～24h內(nèi)應(yīng)為應(yīng)用活血化瘀類藥的最佳時(shí)機(jī)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)性ICH后不同時(shí)間點(diǎn)使用紅花注射液治療均有效果。6h治療組和12h治療組治療效果優(yōu)于其他組。從行為學(xué)表現(xiàn)來看，從術(shù)后6h開始對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，各治療組神經(jīng)功能缺失癥狀明顯輕于出血對照組，但各治療組組間比較無差異。從凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況來看，各治療組均能減少腦出血后的出血灶周圍凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，升高Bcl-2/Bax的比值，與出血對照組相比較差異有顯著性，且出血灶周圍Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)情況與TUNEL染色結(jié)果相一致。正常對照組組的Bcl-2/Bax的比值接近于1。對本實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間用藥的結(jié)果進(jìn)行分析表明，在大鼠腦出血后6h以前給紅花注射液治療，與大鼠腦出血后6h以后給紅花注射液治療相比較出血灶周圍Caspase-3陽性細(xì)胞明顯增加、Bcl-2/Bax比值明顯降低，提示紅花注射液在腦出血后6h以前用藥效果不理想，可能與紅花注射液在出血同時(shí)給藥時(shí)抑制血小板聚集［9］，加重腦出血有關(guān)。從TUNEL陽性表達(dá)情況來看，紅花術(shù)后6h治療組和紅花術(shù)后24h治療組凋亡率低于出血對照組，并且紅花術(shù)后6h治療組較紅花術(shù)后24h治療組血腫周圍TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)有所減少，但差異無顯著性。在大鼠腦出血后6、12、24h注射紅花注射液，出血灶周圍Caspase-3陽性細(xì)胞逐漸增多、Bcl-2/Bax比值逐漸降低，與TUNEL染色結(jié)果相一致，提示紅花注射液在大鼠腦出血6h以后盡早用藥效果比較理想，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道一致。推測其可能與通過促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而降低血腫周圍凋亡細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。另外在本實(shí)驗(yàn)中，在大鼠腦出血后0h給予紅花注射液治療，有1例血腫周邊見可到新鮮出血灶，說明出血6h以內(nèi)應(yīng)慎用活血化瘀藥物來治療腦出血。但在腦出血后康復(fù)治療階段應(yīng)用紅花注射液治療腦出血的效果如何有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，紅花注射液早期治療實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血可明顯減少血腫周圍的細(xì)胞凋亡率，腦出血6h以內(nèi)應(yīng)慎用活血化瘀藥物來治療腦出血，腦出血6h以后盡早用藥效果較理想。

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