保健食品中大豆異黃酮的檢驗(yàn)方法

保健食品中大豆異黃酮的檢驗(yàn)方法 高效液相色譜（HPLC）法中華人民共和國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明．任務(wù)來(lái)源國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《保健食品中大豆異黃酮的檢驗(yàn)方法》制修訂是根據(jù)全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的要求，由朝陽(yáng)區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)，與紅牛維他命飲料有限公司協(xié)作，進(jìn)行制訂工作（項(xiàng)目編號(hào)：20079432-T-469）,根據(jù)項(xiàng)目?jī)?nèi)容確定了該項(xiàng)工作的具體方案和工作計(jì)劃，按照項(xiàng)目要求開展工作。意義大豆異黃酮是一類具有營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值和治療意義的非固醇類物質(zhì)，也是目前國(guó)際上公認(rèn)的安全有效的天然植物雌激素。目前發(fā)現(xiàn)的大豆中天然存在的大豆異黃酮共有12種,分為游離型的甙元和結(jié)合型的糖甙兩類，游離型的甙元約占總量的一，包括染料木素大豆黃素 和黃豆黃素 結(jié)合型的糖甙約占總量的一。已發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，具有多種生物活性，如對(duì)腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和更年期綜合癥預(yù)防與治療作用。因此，當(dāng)前國(guó)際上特別是美國(guó)和日本對(duì)大豆異黃酮開展了大量的應(yīng)用研究工作，以大豆異黃酮為主要成分的保健食品已成為一種新型暢銷食品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上含有大豆異黃酮的保健食品達(dá)數(shù)十種之多。主要有片劑、膠囊、口服液、飲料等。例如，威海清華紫光科技生產(chǎn)的金奧力大豆異黃酮膠囊，成都中科生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的天雌大豆異黃酮營(yíng)養(yǎng)片（膠囊）、紅牛維他命飲料有限公司開發(fā)的大豆異黃酮保健飲料、廣東九極日用保健品有限公司生產(chǎn)的九極牌麗延口服液等。美國(guó) 公司開發(fā)出添加了大豆異黃酮的運(yùn)動(dòng)飲料，美國(guó)加州 食品公司開發(fā)含大豆異黃酮、蛋白質(zhì)、碳水化合物、23種維生素和礦物質(zhì)的能量飲料。不同的產(chǎn)品，大豆異黃酮的含量也不同，目前保健品市場(chǎng)上片劑一般每片（ ）約含大豆異黃酮幾十毫克，膠囊每粒含大豆異黃酮幾十毫克，口服液飲料每一百毫升含大豆異黃酮幾十到上百毫克，大豆異黃酮粉末含大豆異黃酮為每克一百到幾百毫克。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)含大豆異黃酮的保健食品廠家很多，有的產(chǎn)品標(biāo)示的大豆異黃酮含量與實(shí)際含量差別很大，實(shí)際含量遠(yuǎn)小于標(biāo)示含量，保健品市場(chǎng)有待于進(jìn)一步規(guī)范。為了保障消費(fèi)者的利益，也為企業(yè)提供更好的技術(shù)支持，因此建立一種相對(duì)統(tǒng)一、簡(jiǎn)便適用、經(jīng)濟(jì)的測(cè)定保健食品中大豆異黃酮含量的檢測(cè)方法是很必要的。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法研究進(jìn)展作為一種天然有效的抗氧化劑，大豆異黃酮越來(lái)越受到重視，對(duì)其功能性研究，生物活性研究以及產(chǎn)品開發(fā)也是越來(lái)越廣泛。但是純凈的大豆異黃酮難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、等有機(jī)溶劑。大豆異黃酮的性質(zhì)限制了它在飲料等食品體系中的應(yīng)用，但是隨著保健品市場(chǎng)的逐漸升溫，各種聲稱含有大豆異黃酮成分的保健品和食品越來(lái)越多，但是國(guó)家并未制定統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)僅有農(nóng)業(yè)部于200年27月1日開始實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 5大豆異黃酮》，它主要針對(duì)大豆異黃酮產(chǎn)品。衛(wèi)生部出版的《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》 版中有用法測(cè)定染料木素和大豆黃素的方法。雖然許多學(xué)者建立了基于不同系統(tǒng)分析大豆異黃酮含量的方法，如紫外分光光度法，該方法簡(jiǎn)便，但特異性較差；薄層掃描法 操作簡(jiǎn)便。分離效果較好，但顯色劑用量難于控制，人為誤差較大；氣相色譜法進(jìn)樣量少、高敏感性、高選擇性、但在測(cè)定大豆黃素和染料木素時(shí)需要制備衍生物，樣品制備步驟較多，耗時(shí)長(zhǎng)；毛細(xì)管電泳法速度快，選擇性高，儀器價(jià)格昂貴，難以普及；高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，易于定性和定量但因儀器價(jià)格昂貴，普及困難；高效液相色譜法 測(cè)定樣品范圍廣，樣品制備步驟少，成本低，分離效率高，靈敏度好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，而且可有多種檢測(cè)器供選擇。所以本課題組通過查詢資料和調(diào)研，選擇高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定保健食品中大豆異黃酮的含量。實(shí)驗(yàn)部分色譜條件的選擇流.動(dòng)1相的選擇：參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，選擇了乙睛-水作為流動(dòng)相，比較了在相同的進(jìn)樣量情況下，不同pH值（pH=5.0,4.0,3.5,3.0）的流動(dòng)相對(duì)大豆異黃酮分離效果的影響。在pH較高時(shí)，大豆黃素、黃豆黃素和染料木素的峰有拖尾現(xiàn)象，在pH值3.0時(shí)峰型較好，拖尾現(xiàn)象得到改善。通過上述試驗(yàn)的比較，最終確定色譜流動(dòng)相為：乙腈-水（pH3.0）；梯度洗脫： ?乙腈，?m?乙腈?m?乙腈? m 乙腈? ，乙腈， ? 。此條件下，保留時(shí)間和峰面積比較，有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。一次開機(jī),連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5天,以下六個(gè)分別為第21,38,49,107,123,124針?biāo)M(jìn)標(biāo)樣的保留時(shí)間，見表1。表格1六次進(jìn)樣保留時(shí)間比較單位：min名稱ff次數(shù)- 平均值（）大豆苷 13.37173.35103.33123.37143.3713.30103.350.2黃豆苷 14.27114.24124.23174.27154.27174.20114.250.2染料木苷 19.90119.82139.80119.89109.90119.79169.850.2大豆黃素 32.0231.9531.932.0732.08321.02321.851.2黃豆黃素 33.3363.3033.29323.36323.38323.27353.330.1染料木素 43.73493.52443.50473.81453.82423.49473.650.3檢.測(cè)2波長(zhǎng)的選擇：對(duì)以大豆苷、黃豆苷、染料木苷、大豆黃素、黃豆黃素和染料木素進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)范圍：220nm? ，光譜圖見附頁(yè)。通過光譜圖比較，這六種物質(zhì)在 有最大吸收，因此選定 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。.標(biāo)3準(zhǔn)工作曲線和線性范圍配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定。線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2和附頁(yè)2。表格表格2標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)列表樣品名稱濃度IJ大豆苷峰面積線性方程相關(guān)系數(shù)黃豆苷染料木苷大豆黃素黃豆黃素染料木素由表2可知，本方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍較寬，0?120|Jg/mL線性良好。2樣品處理4.2.提1取溶劑的選擇大豆異黃酮難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，選擇了80甲%醇提取保健食品中的大豆異黃酮成分，80的%甲醇提取的樣品色譜圖見附頁(yè)3。保健食品片劑和粉末一般以淀粉和糊精作為填充劑，80的%甲醇能夠使淀粉和糊精沉淀，另外能夠有效提取大豆異黃酮成分；軟膠囊含油脂，用80的%甲醇作為萃取劑，一方面大大降低了油脂的溶解度，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，也可以有效提取大豆異黃酮。保健飲料中的大豆異黃酮可溶于水，可以直接用80%甲醇提取。.超2聲時(shí)間的選擇保健食品中組分復(fù)雜，含有淀粉、糊精、油脂、蛋白等各種成分，能夠包容大豆異黃酮有效成分，通過超聲萃取能夠快速有效的提取。本實(shí)驗(yàn)選擇0min,10min,20min,30min,40min進(jìn)行超聲處理。結(jié)果見圖1。硬膠囊（粉劑）軟膠囊（液體）硬膠囊（粉劑）軟膠囊（液體）圖1超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響從上圖可以看出，超聲時(shí)間對(duì)軟膠囊提取影響較明顯，超聲波能夠使軟膠囊中油狀物破乳，大豆異黃酮成分能夠更加快速被甲醇萃取出來(lái)，但是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量沒有明顯增加，選定超聲時(shí)間為20min。硬膠囊（粉劑），粉劑為粉末狀物質(zhì)，它能夠較好的分散于80%的甲醇中，使得其中的大豆異黃酮組分比較容易被提取，所以超聲20min已能夠完全提取。本方法的檢出限本方法的檢出限：進(jìn)樣量為0J時(shí)，大豆苷 d黃豆苷 和染料木苷 、大豆黃素 、黃豆黃素 和染料木素 的最低檢出濃度均為：J,最低檢出量如下以大豆異黃酮為主要功能性成分的片劑、膠囊及大豆異黃酮粉末 口服液的最低檢出量為 ，保健飲料最低檢出量為 。本方法的重復(fù)性和精密度按照本方法，選擇五種代表性的大豆異黃酮保健食品進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)性測(cè)定，結(jié)果表明本方法精密度好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，適合推廣應(yīng)用。部分結(jié)果見下表。表中，以大豆異黃酮總量計(jì)mg/g,飲料的單位為Jg/mL。表格3日內(nèi)重復(fù)性單位：mg/g膠囊56.2860.3558.9059.2258.6859.7858.872.4粉末104.71105.31705.71907.71203.41306.61405.611.4片劑35.1734.7633.9533.7433.0434.2734.162.2飲料106.671.1表格表格4樣品中六種大豆異黃酮成分的重復(fù)性單位：mg/g平均值名稱單位：mg/g平均值名稱名稱''J大豆苷黃豆苷染料木苷大豆黃素黃豆黃素染料木素通過表4可以看出，六種大豆異黃酮日內(nèi)重復(fù)性較好，精密度較高。按照本檢驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行日間重復(fù)性測(cè)定：間隔兩天，共測(cè)定三次，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表格5日間重復(fù)性單位：mg/g平均值大豆苷黃豆苷染料木苷大豆黃素黃豆黃素染料木素5本方法的準(zhǔn)確度按照本檢驗(yàn)方法對(duì)樣品飲料、片劑、膠囊、口服液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率見表6。表格6表格6飲料（空白）加標(biāo)回收名稱實(shí)際測(cè)定均值IJ 加標(biāo)量IJ 平均回收率（）TOC\o"1-5"\h\z1.94 2.04 95大豆苷 10.10 10.20 99 2.12 2.16 98黃豆苷 10.60 10.80 98 1.60 1.55 103染料木苷 7.96 7.75 103大豆黃素 12.70 12.95 98 1.79 1.87 96黃豆黃素 9.59 9.35 103 2.07 2.00 104染料木素 9.80 10.00 98 表格7片劑（空白）加標(biāo)名稱 實(shí)際測(cè)定均值 加標(biāo)量 平均回收率（）0.250 0.255 98