基因工程操作的程序

基因工程操作的程序第一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的一種酶。能將外來(lái)的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。4000種。1、來(lái)源：2、種類(lèi)：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端平末端第二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。限制酶什么叫黏性末端？第三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五限制酶什么叫黏性末端？第四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五什么叫黏性末端？

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五什么叫平末端？

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。第六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的。圖1-1限制酶識(shí)別序列的中心軸線第八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、“分子縫合針”——DNA連接酶1、種類(lèi)：2、作用部位：E·coliDNA連接酶:T4DNA連接酶:

磷酸二酯鍵

DNA連接酶可把兩個(gè)DNA片段之間的縫隙“縫合”起來(lái)，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。只能連接黏性末端連接黏性末端和平末端第九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五T磷酸二酯鍵1234512345A第十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五右圖示某DNA片段，有關(guān)該圖的敘述中，不正確的是A．②③④可形成DNA的基本組成單位B．②③④構(gòu)成的結(jié)構(gòu)在DNA中特定排列順序可代表遺傳信息C．某限制性?xún)?nèi)切酶可選擇⑦作為切點(diǎn)D．DNA連接酶可連接①處斷裂的化學(xué)鍵C第十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？答：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱(chēng)之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱(chēng)為T(mén)4連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？第十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。第十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、“分子運(yùn)輸車(chē)”—基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體：第十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五§1.2基因工程的基本操作程序第十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。第二十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子第二十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：第二十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第二十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第二十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定第二十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫(kù)中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成第二十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)基因文庫(kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如:cDNA文庫(kù)）1.基因文庫(kù)第二十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系第二十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法①鳥(niǎo)槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因第二十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)(cDNA)第三十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法第三十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專(zhuān)一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?第三十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五①概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動(dòng)子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因有一段已知目的基因的核苷酸序列第三十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR三步曲

預(yù)變性保溫變性90~95℃延伸70~75℃退火55~60℃第三十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)參數(shù)：

變性94℃20s退火52℃20s延伸72℃20s

預(yù)變性94℃30s

保溫72℃30s循環(huán)次數(shù)30第三十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第三十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第三十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高完全自動(dòng)化標(biāo)本純度要求低第三十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

PCR儀的介紹中學(xué)專(zhuān)用PCR儀科研用PCR儀第三十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

中學(xué)專(zhuān)用PCR儀是我公司根據(jù)生物新課標(biāo)要求，結(jié)合中學(xué)教學(xué)特點(diǎn)研制而成的。本產(chǎn)品也是經(jīng)過(guò)教儀所專(zhuān)家質(zhì)檢認(rèn)證的，專(zhuān)門(mén)為中學(xué)教學(xué)而設(shè)計(jì)，與科研用儀器相比具有許多優(yōu)點(diǎn)：

1.操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)直觀

2.PCR原理完整展現(xiàn)

3.彩色大屏幕，中文菜單，便于學(xué)習(xí)加深理解第四十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同第四十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——

核心同一種(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.過(guò)程:第四十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因它們有什么作用？第四十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第四十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍(雙子葉植物和裸子植物)(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第四十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞第四十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（2）程序：(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）思考：為什么選用微生物作為受體細(xì)胞？（2）方法：第四十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第四十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第四十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒第五十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）以下說(shuō)法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基