基因突變和損傷的修復

基因突變和損傷的修復第一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五基因突變的類型和符號常用的幾個突變株突變發(fā)生的機理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)保證遺傳穩(wěn)定的機制(損傷DNA的修復)第二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)基因突變的類型和符號一、基因的符號

nodA（nodule結(jié)瘤基因Ａ）;nifA（nitrogenfixation固氮基因Ａ）;

trpA,trpB（tryptophan色氨酸）;

trpA23,trpA46

（同一基因的不同突變位點）;第三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五leu-,strr;(營養(yǎng)缺陷，抗性)lacZ-

;(表型符號為正體LacZ);Δ(lac,pro);（缺失）trpA::Tn5

;（插入）E.coliJM109;

E.coliDH5α;

（菌株）E.coliJM109Δ(lac,proAB)trpA::Tn5

第四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五二、基因突變的類型按照突變體表型特征不同分類：１、形態(tài)突變型，例如第五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五２、營養(yǎng)缺陷型Ade-

３、抗性突變型Strr

４、致死突變型

5、條件致死突變型

6、產(chǎn)量突變型第六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五按照突變所引起的遺傳信息的改變分類：１、錯義突變同一位置上的氨基酸改變

GAA(E)→AAA(K)

２、同義突變同一位置上的氨基酸不變

GAA(E)→GAG(E)３、無義突變堿基突變后形成終止密碼子

GAA(E)→UAA(stop)第七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五１、堿基置換轉(zhuǎn)換PyPy

PuPu

顛換PyPu轉(zhuǎn)換比顛換更常見按照遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變分類：第九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五２、移碼突變（編碼區(qū)）ATCGAATTCGGGTATTTAATCGAATTCGGGTATTTACGAATCCGAATTCGGGTATTTAATCCGGAATTCGGGTATTTAATCCGAGAATTCGGGTATTTA第十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五３、DNA片段插入和缺失

DNA大片段的缺失或重復，在放線菌中缺失范圍從幾個基因到幾十個基因。第十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)常用的幾個突變株營養(yǎng)缺陷突變株溫度敏感突變株抗性突變株第十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五例：供體E.coli(HfrStrs)受體E.coli(F-Thr-Leu-Thi-Strr)在含有鏈霉素和硫胺素的基本培養(yǎng)基只能分離到蘇氨酸和亮氨酸的重組子第十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)突變發(fā)生的機理

(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)

第十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五１、自發(fā)突變

·堿基異構(gòu)式引起DNA復制過程的錯誤

a)堿基異構(gòu)式

C(氨基)C(亞氨基)

A(氨基)A(亞氨基)

G(酮式)G(烯醇式)

G(酮式)

G(烯醇式)

T(酮式)

T(烯醇式-2’)orT(烯醇式-4’)

1,65,6第十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五OH第十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五b)堿基異構(gòu)式引起DNA復制的錯配

第十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五A(a)

T(k)

G(k)C(a)

正確配對

錯誤配對

G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

第二十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五A(a)

T(k)

C(i)

A(a)

C(i)

C(a)G(k)例如：環(huán)出效應轉(zhuǎn)座子第二十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五環(huán)出效應第二十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五２、誘發(fā)突變

2-1物理誘變a)電離輻射誘變；

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

衛(wèi)星搭載誘變；

高真空，強輻射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射處理）

(α)(β)ray非穿透性

（內(nèi)標記處理）

dNTP電荷及結(jié)構(gòu)改變

第二十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五電離輻射引起DNA損傷的機理第二十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五b)非電離輻射—UltraVioletlight(U.V)---pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧第二十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五2-2生物技術(shù)定點誘變

第二十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五PCR原理解鏈退火延伸第二十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五基因的定點誘變

oligo-dNt介導的定點誘變

合成與目標基因某區(qū)段互補并含突變位點的oligo-dNt

第二十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五突變oligo-dNt引物介導的PCR誘變目標基因克隆到質(zhì)粒中分為兩管

每管加入2個特定引物一個與基因內(nèi)某一區(qū)段互補（2，4）一個含突變堿基并與欲突變位點互補（1，3）

PCR產(chǎn)物混合變性、復性轉(zhuǎn)化E.coli第二十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五PfuDNApolymerasefromPyrococusfuriosus(火球菌屬)

具有3’→5’exonuclease活性，校正復制時堿基的錯配復制高保真，聚合長度1.5-2.0kb

兩引物5’端連接其中引物1中含欲突變的堿基

Pfu-PCR直接誘變法第三十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五引物2合成的新生鏈不會使引物1靶序列發(fā)生替代

未被引物2擴增的DNA，含有未突變的酶切位點，經(jīng)酶解后成線狀，轉(zhuǎn)化E.coli不能穩(wěn)定存在

改進型引物的PCR誘變

目標基因克隆到M13載體提取單鏈DNA為模板

設(shè)計兩引物分別與模板不同區(qū)段互補

引物1與目標基因互補，含一突變堿基，并5’端磷酸化

引物2含一酶切位點，并造成酶切位點突變

12第三十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五兩通用引物（commonP1&commonP2）

設(shè)計兩突變引物（mut.P1&mut.P2）

第一次兩種PCR產(chǎn)物混合，變性，復性

其中一對雙鏈分子不能進行第二次PCR

另一對雙鏈分子的PCR產(chǎn)物為誘變基因

引物重疊延伸的PCR誘變

cP1

mP1mP2cP2第三十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五基于PCR的隨機誘變目標基因克隆于含兩酶切位點（REA,B）的質(zhì)粒載體REA,B酶切克隆子，exonucleaseIII酶解目標基因3’斷口的單鏈Klenow片段dNTP一種堿基類似物（誘變劑）在聚合DNA過程中隨機造成誘變第三十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五

DNAshuffling技術(shù)的基因誘變Mutants.

Digestionligation

transformationselection第三十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五2-3化學誘變a)干擾堿基合成的化學誘變劑6-Mercaltopurine5-AminoUracil5-氨基尿嘧啶(5-AU)和6-氮嘌呤(6-NP)

第三十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五b)堿基類似物導致的堿基錯配(5-BrU)BrBr第三十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGC復制錯誤A/TG/C摻入錯誤G/C

A/T第三十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)復制錯誤摻入錯誤5-BrU(k)5-BrU(e)第三十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GC復制錯誤A/T

G/C摻入錯誤G/C

A/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)難易AGGATCCT>第三十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五HNO2(NitrousacidNA)

ACGHypoxanghineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2

堿基修飾引起的化學突變第四十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五羥胺的致突變作用NH2OH(HydroxylamineHA羥胺)C(羥化)A(a)OHNH羥化胞嘧啶

GCAT第四十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五d)烷化劑EMS(Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子氣)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl第四十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五甲基化第四十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五誘變效應；使堿基多處發(fā)生烷化，導致DNA結(jié)構(gòu)變異敏感位點H2NOOOCTN3,C4-NN3,C4-OAGN1,N3,C6-N,N7,C8N1,C2-N,N3,C6-O,N7,C8H2NONHH第四十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五

Apurination(de-pu)脫嘌呤作用CH3CH2GMPCH3CH2-OC6-O-烷基嘌呤=TC4-O-烷基胸腺嘧啶=GG

GCH2CH2—S--CH2CH2H烷化堿基電離異構(gòu)式錯配多功能烷化劑DNA分子交聯(lián)畸變GXTO7-烷基鳥嘌呤第四十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五e)嵌合劑和移碼突變AO(AcridineOrange)扁平分子EB(EthidiumBromide)-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入異相退火AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-----AAAAA-----AAAAATTTTT------TTTTT----AAAAA--TTTTT--AAAAA--TTTTT-RE---AAAAA------TTTTT------AAAAAA------TTTTTT---+重組XAAAAGC-TA第四十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)保證遺傳穩(wěn)定的機制（損傷DNA的修復）第四十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五復制過程中的錯配修復DNA的損傷修復基因的回復突變密碼的簡并致死突變多倍體……復制過程中的錯配修復機制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)經(jīng)第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem注：polI具有3'--5'的核酸外切酶活性（瞬時，廣義上的校對和修復功能）第四十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五1、DNA的復制修復

1-1MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生鏈中錯配堿基識別新生鏈中非m6A的GATC序列酶切含錯配堿基的新生DNA區(qū)段第四十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)

為m6A甲基化敏感位點平均每2kb左右有一GATCseq.3’-------C----------CTAG----------CTAG----5’

5’-----------T----------GATC----------GATC----3’

3’-------------------------------------------------------

5’少梯度多（m6A）新生鏈第五十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGCTAGTCGATCGATCCTAGCTAGTGATCGATCCTAGCTAGTA第五十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五1-２(尿嘧啶-)N-糖苷酶系統(tǒng)---TAGC------ATCG------TAGC------ATG---U---TAGC---ung-aseGTUAU---TAGC------ATG---Apurinase(內(nèi)切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---第五十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第五十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五光復活酶471aa2、DNA的損傷修復2-1光復活----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可見光激活第五十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五2-2切除修復BeforeReplicationError-freeUvrA,B,CgeneEndonucleasesExonucleaseDNApolLigase切除修復步驟：識別DNA鏈中的損傷部位損傷部分被切離修復第五十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第五十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五第五十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五動畫第五十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五E.coli

存活%U.V計量w.t.uvrA+recA+recA+

uvra-recA-

uvrA-recA.gene

以某種方式參與DNA損傷修復2-3重組修復第五十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五

重組修復

(strandtransferrepair)Afterreplicationrepair

RecA,DNApolymeraeligasegenesbeneeded第六十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五2-4

SOS修復JeanWeagleE.coliE.coliE.coliλ8010100mut.100%50%10%

E.coli中噬菌體損傷的DNA被修復AU.V.誘導了E.coli

的SOS修復(A&B)SOS修復高頻率的突變(Error-prone)ABC第六十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期五DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexA

SOSUmnCmuta