核酸實(shí)時定量檢測技術(shù)之實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)原理-醫(yī)學(xué)院課件

1核酸實(shí)時定量檢測技術(shù)之實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)原理實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（realtimeQ-PCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過相關(guān)數(shù)據(jù)分析方法對目的基因進(jìn)行定量分析的技術(shù)。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)23激發(fā)光發(fā)射光Ct值實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)1.擴(kuò)增曲線是指對整個熒光定量PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的監(jiān)測和連續(xù)地分析，將監(jiān)測到的熒光信號繪制成一條以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的曲線。一、常用的概念42.熒光閾值（threshold）設(shè)置在基線信號標(biāo)準(zhǔn)偏差×10，當(dāng)熒光信號大于閾值時，可以肯定是由于PCR的擴(kuò)增使得熒光強(qiáng)度得以測量。熒光閾值設(shè)置在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。。5基線：信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大。3.循環(huán)數(shù)（cyclethresholdvalue,Ct值）即PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。Ct值可以相對判定起始模板量。64.擴(kuò)增效率（amplificationefficiency，E）是指PCR反應(yīng)一個循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個循環(huán)的模板量的比值，其值在0～1之間。一般情況下，在PCR反應(yīng)的前20個或30個循環(huán)，E值比較穩(wěn)定，為指數(shù)擴(kuò)增期，之后隨著反應(yīng)進(jìn)行逐漸進(jìn)入平臺期，E值逐漸下降至0，不再擴(kuò)增。7在PCR中，隨著擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)次數(shù)的增加，模板以指數(shù)的方式進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增一定的周期后，擴(kuò)增產(chǎn)物的總數(shù)量可以用以下公式來表示：理想的反應(yīng)式：Yn=X·2n實(shí)際反應(yīng)式：Yn=X·(1+E)nYn：PCR產(chǎn)物的量X：原始模板的數(shù)量E：擴(kuò)增效率n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)二、PCR擴(kuò)增的理論模式8在實(shí)時熒光定量PCR中，公式可表示如下：YCt=X·(1+E)Ct整理得:Ct=-lgX/lg(1+E)+lgYCt/lg(1+E)Yct：實(shí)時熒光定量PCR熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值線時擴(kuò)增產(chǎn)物的量對于每一個特定的PCR反應(yīng)而言，E與YCt均為常數(shù)，Ct值與lgX成負(fù)相關(guān)，也就是說，初始模板的對數(shù)值與PCR的循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，因此，可根據(jù)擴(kuò)增達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)就可以計算出樣品中所含靶基因的量。910實(shí)時熒光定量PCR--絕對定量利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣本的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算出待測樣本的起始拷貝數(shù)。11絕對定量實(shí)時熒光定量PCR中的熒光化學(xué)物質(zhì)12TaqManProbe雙雜交探針MolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。（一）熒光染料技術(shù)13SYBRGreenI14Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFF延伸期完成后檢測信號優(yōu)點(diǎn)：熒光染料的成本低；無須對引物或探針進(jìn)行預(yù)先特殊的熒光標(biāo)記；適用于任何反應(yīng)體系，操作亦比較簡單；缺點(diǎn)：SYBRGreenⅠ染料能與任何雙鏈DNA結(jié)合，因此，它也會結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子或引物二聚體中，使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽性信號。15SYBRGreenI法熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（FRET）：當(dāng)一個熒光基團(tuán)與一個淬滅基團(tuán)的距離接近一定的范圍，就會發(fā)生熒光能量的轉(zhuǎn)移，淬滅基團(tuán)就能吸收熒光基團(tuán)發(fā)生的熒光。（二）熒光探針技術(shù)1617TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個報告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQ18RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖

在每個循環(huán)的延伸過程中檢測熒光信號。優(yōu)點(diǎn)：該技術(shù)解決了熒光染料技術(shù)非特異的缺點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后無需進(jìn)行寡核苷酸熔解曲線分析，減少了實(shí)驗(yàn)時間；缺點(diǎn)：TaqMan探針兩側(cè)R基團(tuán)與Q基團(tuán)相距較遠(yuǎn)，淬滅不徹底，本底較高；TaqManProbe法19202.雙雜交探針技術(shù)第一條探針的3’端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)。第二條探針的5’端標(biāo)記受體熒光基團(tuán)，封閉的3’端在PCR擴(kuò)增過程中，兩條探針與目的基因同時雜交時，供體熒光基團(tuán)與受體熒光基團(tuán)相互靠近，供體熒光基團(tuán)刺激附近的受體熒光基團(tuán)，使后者發(fā)光而被檢測系統(tǒng)接收。21Oligo1:FluoresceinOligo2:

LCRed640FRETProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞雙雜交探針技術(shù)原理示意圖兩個探針都必須結(jié)合到正確的目的序列時，才能檢測到熒光，對信號的檢測是在退火后進(jìn)行。該方法特異性增強(qiáng)。但需要合成兩條探針，成本較高。223.分子信標(biāo)技術(shù)當(dāng)無目的序列存在時，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，此時由于兩端的基團(tuán)相距非常接近，此時沒有熒光信號。當(dāng)有目的序列存在時，分子信標(biāo)與靶序列特異性結(jié)合，環(huán)狀區(qū)單鏈與靶序列雜交而形成穩(wěn)定的、比柄區(qū)更長的雙鏈，從而使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，此時可檢測到熒光。分子信標(biāo)實(shí)際上是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸，結(jié)構(gòu)由環(huán)狀區(qū)和柄區(qū)組成，5’末端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3’末端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。23RQExcitationXRQQRExcitationEmission當(dāng)有目的基因存在時，分子信標(biāo)與靶序列特異性結(jié)合，對信號的檢測是在退火后進(jìn)行。分子信標(biāo)技術(shù)原理示意圖24優(yōu)點(diǎn)：具有背景信號低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等；缺點(diǎn)：莖環(huán)結(jié)構(gòu)在PCR反應(yīng)變性時有時不能完全打開，探針不能完全與靶基因結(jié)合，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。RT-PCR的概念；實(shí)時熒光定量PCR常用的熒光染料及其作用機(jī)理；實(shí)時熒光定量PCR的應(yīng)用。小結(jié)2526第七章核酸序列分析核酸序列分析，亦稱核酸測序技術(shù)，簡稱測序（sequencing）是指分析特定RNA或DNA片段的堿基序列，確定其方向與結(jié)構(gòu)，對突變進(jìn)行定位、鑒定和比較研究。第一代DNA測序技術(shù)2728第一代DNA測序技術(shù)：傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)。70年代后期，Sanger建立了雙脫氧鏈終止法，Maxam‐‐‐‐Gilbert等人建立了化學(xué)裂解法。29雙脫氧鏈終止法測序原理DNA鏈中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是2’-脫氧核苷三磷酸。2’,3’-ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基。3031ddNTP1.進(jìn)行測序反應(yīng)在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，在ddNTP的位置，鏈延伸終止。32332.凝膠電泳和序列讀取在4組獨(dú)立的酶促反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。電泳方向34圖中為雙脫氧末端終止法測序凝膠圖譜分析，從圖中得出待測靶DNA堿基順序?yàn)椋ǎ〢．AACGTGGACTB．TTGCACCTGAC．AGTCCACGTT

D．TCAGGTGCAAE．UGTCCUCGTT35測序反應(yīng)體系（一）DNA模板：單鏈DNA模板、雙鏈DNA模板、PCR產(chǎn)物（二）測序引物：測序引物分自帶引物和通用引物。（三）DNA聚合酶:Klenow片段、測序酶、耐熱DNA聚合酶（四）熒光標(biāo)記：放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記36以熒光化合物標(biāo)記雙脫氧核苷酸的自動測序

熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個反應(yīng)在一個試管中進(jìn)行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過熒光監(jiān)測儀時，可由光信號讀出末端核苷酸并由電腦記錄。自動DNA測序儀37自動測序技術(shù)的改進(jìn)：同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記，平板電泳到毛細(xì)管電泳38Sanger測序技術(shù)的缺點(diǎn)1、DNA鏈終止+電泳法決定了一個反應(yīng)所測序列不能太長，目前1000‐1200bp左右。2、測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，有些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測序。3、依賴電泳分離技術(shù)，成本高，通量低。

新一代(NextGenerationSequencing)測序技術(shù)可一次性對幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測序，又稱為高通量測序(High‐throughputSequencing)技術(shù)，其使得可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序(DeepSequencing)。新一代測序技術(shù)39一、基本原理和工作流程第二代測序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭，隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成，然后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。所有克隆在同一平面上，反應(yīng)大規(guī)模平行進(jìn)行，每個延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測也能同時進(jìn)行，從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復(fù)，最后經(jīng)計算機(jī)分析獲得完整的DNA序列。4041DNA文庫制備（隨機(jī)或配對末端）DNA片段的固定（平面或微球）DNA片段單分子擴(kuò)增（固定引物PCR或乳液PCR）并行測序反應(yīng)（堿基延伸或連接）光學(xué)圖像采集與處理（熒光或化學(xué)發(fā)光）DNA序列拼接新一代測序技術(shù)工作流程42（一）DNA片段單分子擴(kuò)增1.在芯片表面進(jìn)行：固定引物PCR（橋式PCR）利用固定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)30輪左右擴(kuò)增，每個分子得到了1000倍以上的擴(kuò)增，成為單克隆DNA蔟。432.在磁珠進(jìn)行：乳液PCR帶有接頭的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，每一個磁珠攜帶一個單鏈DNA片段。隨后磁珠乳化，形成油包水的乳濁液結(jié)構(gòu)，每一個小的乳滴都是只包含一個磁珠及PCR試劑的微反應(yīng)器。每個DNA片段產(chǎn)生幾百萬個相同的拷貝。44EmulsionPCRtemplateDNAbeadswithcoupledprimersmicroemulsionsconventionalPCR45（二）并行測序反應(yīng)即測定每個PCR克隆陣列的核苷酸序列。測序方法主要有三種。邊合成邊測序焦磷酸測序寡連測序邊合成邊測序：使用經(jīng)過改造的DNA聚合酶和帶有4種不同熒光標(biāo)記的dNTP。這些dNTP是“可逆終止子”，其3'羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，阻止下一個dNTP與之相連，因此每個循環(huán)只容許摻入單個堿基。用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端黏性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，即可得知模板DNA片段的序列。4647邊合成邊測序示意圖48二、第二代測序技術(shù)的特點(diǎn)基本特點(diǎn)：不需要進(jìn)行DNA模板克隆，而是使用接頭進(jìn)行高通量的并行PCR和并行測序反應(yīng)，并結(jié)合微流體技術(shù)，利用高性能計算機(jī)對大規(guī)模測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。顯著特點(diǎn)：高通量，低成本。49三、第二代測序技術(shù)的應(yīng)用