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文檔簡介
生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)抗生素藥物在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用,與化學藥物相比,具有化學純度較低、活性組分易發(fā)生變異、穩(wěn)定性差等特點。微生物檢定法是在適宜的條件下,通過檢測抗生素藥物對微生物的抑制作用,計算抗生素效價的方法。該方法的測定原理能直接表示抗生素對微生物的作用,是其他物理學方法或化學方法所不能達到的,目前各國藥典仍多數(shù)采用這一方法。依據(jù)設(shè)計原理不同,可分為稀釋法、濁度法和瓊脂擴散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國際通用方法?!吨袊F藥典》首選方法是管碟法。一、生物檢定法概述二、管碟法獸藥檢測技術(shù)當抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴散時,會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度,即擴散的中心濃度高而邊緣濃度低。在抗生素濃度高于MIC(最低抑制濃度)時,試驗菌就被抑制而不能繁殖,從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈??股卦谝欢舛确秶鷥?nèi),對數(shù)劑量與抑菌圈直徑(或面積)呈線性關(guān)系。
1.原理生物檢定定量技術(shù)二、管碟法獸藥檢測技術(shù)將未知效價供試液與已知效價的標準液,在同一條件下,抗生素在培養(yǎng)基內(nèi)的擴散到達適當范圍內(nèi)產(chǎn)生了抑制試驗菌生長的透明抑菌圈,經(jīng)比較供試液和標準液兩者產(chǎn)生的抑菌圈直徑(面積)的大小,計算出供試品的效價。2.方法生物檢定定量技術(shù)二、管碟法獸藥檢測技術(shù)二劑量法是最常用的一種方法,系將供試品和標準品分別配制成高低兩個濃度,高低濃度的比值(稱為劑距)為2︰1或4︰1,在每個雙碟內(nèi)放置4個小鋼管,對角的兩個小鋼管內(nèi)分別滴裝高濃度和低濃度的標準品溶液,其余兩個小鋼管分別滴裝高濃度和低濃度的供試品溶液,在規(guī)定條件下培養(yǎng)后進行測定比較。2.方法生物檢定定量技術(shù)
供試品效價相當于標示量或估計效價的百分數(shù)為:
P為供試品效價(相當于標示量或估計效價的百分數(shù));S2為高濃度標準品溶液所致抑菌圈直徑(或面積)總和;S1為低濃度標準品溶液所致抑菌圈直徑(或面積)總和;T2為高濃度供試品溶液所致抑菌圈直徑(或面積)總和;T1為低濃度供試品溶液所致抑菌圈直徑(或面積)總和;I為高濃度與低濃度比值的對數(shù)值(即劑距的對數(shù)值)。獸藥檢測技術(shù)生物檢定定量技術(shù)將此百分數(shù)乘以供試品估計的效價數(shù),即得供試品每1mg中所含的單位數(shù)(U/mg)。供試品的效價數(shù)(Pr)=估計效價數(shù)(Ar)×P本法計算所得效價,如低于估計效價的90%或高于估計效價的110%時,則應調(diào)整其估計效價,予以重試。獸藥檢測技術(shù)生物檢定定量技術(shù)(1)稱量(2)稀釋(3)雙碟的制備①培養(yǎng)基底層的制備②培養(yǎng)基菌層的制備(4)放置小鋼管(5)滴加抗生素溶液
(6)培養(yǎng)(7)抑菌圈測量(8)記錄與數(shù)據(jù)處理(9)結(jié)果判定制備雙碟檢定步驟配制抗生素溶液
生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)(1)稱量
☆標準品與供試品的稱量均為一次取樣稱取。生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)二、管碟法3.二劑量法步驟生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)(2)稀釋☆采用容量瓶☆取樣量不得少于2ml
☆稀釋步驟一般不超過3步
☆從“0”刻度開始放溶液。
☆標準品溶液取出須至室溫后方可稀釋☆劑距為2∶1或4∶1。
☆平行原則生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)☆培養(yǎng)基均勻攤布
(3)雙碟的制備☆臺面必須水平
生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)☆平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上(4)放置小鋼管☆小鋼管經(jīng)干熱滅菌生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)☆滴加溶液的順序為SH→TH→SL→TL。(5)滴加抗生素溶液☆成對角滴加標準品(S)及供試品(T)高(H)、低(L)兩種濃度的溶液。生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)(6)培養(yǎng)生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)(7)抑菌圈測量
游標卡尺或抑菌圈測量儀生物檢定定量技術(shù)獸藥檢測技術(shù)(8)記錄、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判斷
包括試驗日期、稱量時天平室溫度、相對濕度,供試品的估計效價、標準品與供試品的稱量、最終稀釋濃度、稀釋步驟,試驗菌名、菌液濃度,培養(yǎng)基、緩沖液,抑菌圈測量結(jié)果、可信限率。雙碟的制備
為硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿,內(nèi)徑約90mm,高16~17mm,底面應水平且厚薄均勻,無氣泡。檢查方法可將雙碟放在水平臺上,下墊一張白紙,碟內(nèi)加水2-3mL,再滴加藍墨水,觀察顏色深淺是否一致。獸藥檢測技術(shù)挑選雙碟雙碟的制備
用過的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后,置玻璃儀器中,用專用洗液或其它清洗液浸泡,再沖洗、晾干,裝在不銹鋼筒內(nèi),置150-160℃干熱滅菌2h或高壓121℃蒸氣滅菌30min,備用。獸藥檢測技術(shù)雙碟的準備雙碟的制備①底層
用滅菌大口吸管或其他滅菌分裝器,吸取已融化的培養(yǎng)基20mL,注入每個雙碟內(nèi)均勻攤布,用陶瓦蓋覆蓋,待其凝固。冬季室溫較低時,倒好的底層雙碟可先放入35-37℃培養(yǎng)箱內(nèi)保溫,使易于攤布菌層。獸藥檢測技術(shù)雙碟的制備雙碟的制備②菌層
取出試驗用菌懸液,按已預試驗的菌量(二劑量法標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm),用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中(一般細菌48-50℃,芽孢可至60℃)的培養(yǎng)基內(nèi),搖勻,作為菌層用。用滅菌大口10mL吸管或其它分裝器,吸取菌層培養(yǎng)基5mL,使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上,置水平臺上,用陶瓦蓋覆蓋,放置20-30min,待凝固備用。獸藥檢測技術(shù)雙碟的制備小鋼管的放置和滴碟
不銹鋼制,外徑(8.0±0.1)mm或(7.8±0.1mm,內(nèi)徑(6.0±0.1)mm,高(10.0±0.1)mm,每套鋼管重量差異不超過±0.5g。小鋼管內(nèi)外壁和兩端要求光滑平坦,管壁厚薄均勻一致。洗凈后晾干,裝在帶蓋的容器內(nèi),150~160℃干熱滅菌2h備用。獸藥檢測技術(shù)準備小鋼管小鋼管的放置和滴碟
將4孔鋼管放置器置于無菌室內(nèi),鋼管下落時應垂直平穩(wěn)、位置正確。應保持清潔,防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦拭,并用乙醇棉火焰燒小孔。獸藥檢測技術(shù)鋼管放置器小鋼管的放置和滴碟①每批供試品二劑量法取6個以上雙碟,滴注小鋼管用的毛細管或定量加樣器須用被滴注的溶液洗2~3次。②每份滴加的溶液為1個單位,但雙碟數(shù)每次不超過5個,如1份溶液滴加雙碟數(shù)目多,可分組滴加。每種溶液各用1支毛細滴管。③每個小鋼管應加至管口平滿,每個小鋼管的裝量應一致。④滴注溶液的次序,最好以一個批號為單位安排,并且標準液與供試品液應輪換滴注。二劑量法中,在雙碟的4個鋼管中分別成對角滴加標準品(S)及供試品(T)高(H)、低(L)兩種濃度的溶液。滴加溶液的順序為SH→TH→SL→TL。⑤滴注完畢后,用陶瓦蓋覆蓋雙碟,置托盤內(nèi),雙碟疊放不可超過3個,避免受熱不均,影響抑菌圈大小,以水平位置平穩(wěn)搬入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。獸藥檢測技術(shù)滴碟小鋼管的放置和滴碟
將已干熱滅菌的小鋼管倒入鋼管放置器的玻璃容器內(nèi),或?qū)⒀b好小鋼管的已干熱滅菌的鋼管放入鋼管自動放置器中,將雙碟打開,放入雙碟臺上,托起雙碟臺,使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上。各個鋼管下落的高度基本一致,鋼管放好后,應使雙碟靜置5~10min,使鋼管在瓊脂內(nèi)下沉穩(wěn)定后,再開始滴加抗生素溶液。獸藥檢測技術(shù)放置小鋼管抑菌圈直徑測量
抑菌圈測量儀或游標卡尺
必須按檢驗規(guī)程檢驗合格。游標卡尺的精
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