細(xì)胞黏附相關(guān)結(jié)構(gòu)的染色標(biāo)記與表征

細(xì)胞黏附相關(guān)結(jié)構(gòu)的染色標(biāo)記與表征YAOXiang染色原理：細(xì)胞黏附一般會涉及到細(xì)胞黏附密度與粘附狀態(tài)的評估（如黏附面積、形狀、焦點(diǎn)黏附強(qiáng)弱），評估細(xì)胞黏附狀態(tài)可以通過利用不同種類的熒光基團(tuán)對不同的細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，后續(xù)再通過熒光顯微成像的方法來對細(xì)胞黏附進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與評估。例如選用如下熒光組合：用 AlexaFluor488熒光基團(tuán)標(biāo)記粘著斑蛋白vinculin（利用抗原-抗體特異性結(jié)合的方式，一抗選用 Mousemonoclonalanti-vinculinantibody，二抗選用AlexaFluor488-conjugatedgoatanti-mouseIgG）；用TRITC熒光基團(tuán)標(biāo)記微絲蛋白（染色試劑一端帶TRITC熒光基團(tuán)，另一端的鬼筆環(huán)肽phalloidin能夠與微絲特異性結(jié)合）；用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記。選用上述熒光組合的典型熒光顯微照片如圖1-3所示（本例雖然展示的均是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的染色顯微照片，但其它種類細(xì)胞黏附相關(guān)結(jié)構(gòu)的染色標(biāo)記與表征均可采用類似方法），對應(yīng)詳細(xì)的染色步驟及所需試劑見后頁內(nèi)容。L-Cys D-Cys圖1：MSC（骨髓基質(zhì)干細(xì)胞）粘附于不同基材（L-CYS,D-CYS）后的vinculin、F-actin和細(xì)胞核的復(fù)合熒光染色照片（merged）。vinculin標(biāo)記為綠色、F-actin標(biāo)記為紅色、細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色。

圖2：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附于玻片表面后的熒光顯微圖片。紅色為F-actin,藍(lán)色為細(xì)胞核。

圖3：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附于特殊基材后的熒光顯微照片。從上到下依次為標(biāo)記為綠色的vinculin、標(biāo)記為紅色的F-actin、標(biāo)記為藍(lán)色的細(xì)胞核在僅考察細(xì)胞的黏附問題時，細(xì)胞黏附到材料上一段時間（依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定，一般需大于4小時）后便可對其同時進(jìn)行vinculin、F-actin和細(xì)胞核的復(fù)合標(biāo)記染色。該熒光組合染色結(jié)果便于觀察細(xì)胞的應(yīng)力纖維絲和焦點(diǎn)粘附情況。具體染色步驟如下：吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS漂洗3次(注意提前將PBS水浴加熱到37°C),每次5min;加入4%的多聚甲醛(注意提前將多聚甲醛溶液水浴加熱到37C),固定15min;吸去固定液，PBS漂洗3次，每次5min;加入0.1%TritonX-100/PBS溶液，破膜處理5min后吸去；PBS漂洗3次，每次5min;加入5%的BSA溶液(降低后續(xù)一抗在細(xì)胞膜表面的非特異性結(jié)合)，封閉處理15min;加入1:100的vinculin一抗(Mousemonoclonalanti-vinculinantibody,購買的母液試劑一瓶大概有0.2ml)稀釋液，4C孵育過夜(或室溫下孵育2.5-3小時)；吸去一抗染液，PBS漂洗3次，去除殘留一抗；加入1:100的二抗(AlexaFluor488-conjugatedgoatanti-mouseIgG,購買母液濃度為2毫克/毫升，使用終濃度選擇為20微克/毫升)稀釋液，室溫下避光染色2h;吸去染液，PBS漂洗3次，去除殘留二抗；加入1Mg/m的phalloidin-TRITC染液(對F-actin進(jìn)行熒光標(biāo)記。該試劑一端帶TRITC熒光基團(tuán)，另一端的鬼筆環(huán)肽phalloidin能夠與微絲特異性結(jié)合)，室溫下避光染色30min;（12）吸去染液，PBS漂洗3次，去除殘留染液;（13） 加入2Mg/m的DAPI染液（對細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記），染色5min;（14） PBS漂洗3次，去除殘留染液；（15） 加入PBS，將樣本置于激光共聚焦顯微鏡或倒置