肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制培訓(xùn)資料

肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制萬(wàn)建國(guó)各級(jí)各類試驗(yàn)室職責(zé)：縣（區(qū)）級(jí)結(jié)核病試驗(yàn)室在省、地（市）參比試驗(yàn)室指導(dǎo)下，制訂本縣（市）結(jié)核病試驗(yàn)室檢驗(yàn)工作計(jì)劃。按照國(guó)家結(jié)核病試驗(yàn)室質(zhì)量確保體系要求，做好本試驗(yàn)室開展檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)室內(nèi)質(zhì)控工作，負(fù)擔(dān)同級(jí)間試驗(yàn)室（縣級(jí)）第一復(fù)檢者盲法復(fù)檢工作，在所屬地（市）級(jí)試驗(yàn)室組織下，開展痰涂片鏡檢盲法復(fù)檢。按國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化操作程序常規(guī)開展痰涂片鏡檢工作，依照實(shí)際情況有能力、具備條件能夠開展結(jié)核菌培養(yǎng)。接收上級(jí)試驗(yàn)室督導(dǎo)、現(xiàn)場(chǎng)評(píng)定和定時(shí)培訓(xùn)。對(duì)轄區(qū)內(nèi)鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院查痰點(diǎn)工作提供技術(shù)支持。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)在我國(guó)結(jié)核病防治工作中發(fā)揮著主要作用，它能夠方便結(jié)核病可疑癥狀者就醫(yī)，增加病人發(fā)覺。各地應(yīng)依照實(shí)際情況設(shè)置鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)應(yīng)該按衛(wèi)生部要求開展工作，國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化操作程序開展痰涂片鏡檢工作，并按要求送痰涂片至縣級(jí)進(jìn)行復(fù)檢；接收上級(jí)試驗(yàn)室培訓(xùn)、現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)和技術(shù)指導(dǎo)。醫(yī)療機(jī)構(gòu)試驗(yàn)室醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核病試驗(yàn)室在對(duì)應(yīng)級(jí)別臨床檢驗(yàn)中心和上級(jí)結(jié)核病試驗(yàn)室技術(shù)指導(dǎo)下，開展質(zhì)量有確保結(jié)核病試驗(yàn)室檢驗(yàn)工作，嚴(yán)格按攝影關(guān)各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作程序進(jìn)行試驗(yàn)室相關(guān)活動(dòng)，并接收結(jié)核病試驗(yàn)室質(zhì)量控制。涂片鏡檢試驗(yàn)室基本要求：試驗(yàn)室應(yīng)有試驗(yàn)室分區(qū)（涂片染色區(qū)域和讀片鏡檢區(qū)域），布局應(yīng)該符合生物安全二級(jí)（BSL-2）要求；試驗(yàn)室應(yīng)在靠近出口處設(shè)置洗手池；試驗(yàn)室墻壁、天花板和地面應(yīng)平整、易清潔、不滲水、耐化學(xué)品和消毒劑腐蝕，地面應(yīng)防滑；試驗(yàn)操作臺(tái)面應(yīng)能防水，耐腐蝕、耐熱；試驗(yàn)室中廚柜和試驗(yàn)臺(tái)應(yīng)牢靠，廚柜、試驗(yàn)臺(tái)彼此之間應(yīng)保持一定距離，方便于清潔；對(duì)于試驗(yàn)室中可開啟窗戶，應(yīng)安裝紗窗；試驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)確保工作照明，防止無(wú)須要反光和強(qiáng)光；應(yīng)有適當(dāng)消毒設(shè)備；在試驗(yàn)室門口處應(yīng)設(shè)掛衣裝置，個(gè)人便裝與試驗(yàn)室工作服分開放置；10、試驗(yàn)室應(yīng)該裝備開展痰涂片檢驗(yàn)所需要儀器和設(shè)備。檢驗(yàn)對(duì)象及要求：痰涂片檢驗(yàn)（一）痰盒推薦使用螺旋蓋、可密封、廣口塑料盒搜集痰標(biāo)本，參考規(guī)格：直徑4厘米，高度2厘米。醫(yī)務(wù)人員在容器上應(yīng)注明患者姓名、編號(hào)（門診序號(hào)或登記號(hào)）、檢驗(yàn)項(xiàng)目、痰標(biāo)本序號(hào)1、2、3（1＝當(dāng)日即時(shí)痰，2＝夜間痰，3＝次日晨痰），然后交給患者。（二）標(biāo)本采集1、時(shí)間依照痰標(biāo)本采集時(shí)間，可將標(biāo)本分為三類：即時(shí)痰：就診時(shí)深呼吸后咳出痰液；晨痰：患者晨起立刻用清水漱口后，咳出第2口、第3口痰液；夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出痰液；2、痰采集方法宣傳教育對(duì)疑似肺結(jié)核病者，臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)經(jīng)過解釋，使其充分了解標(biāo)本質(zhì)量對(duì)對(duì)應(yīng)檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)主要性，示范并指導(dǎo)其掌握從肺部深處咳痰方法；如患者識(shí)字，可提供宣傳教育材料。3、地點(diǎn)因?yàn)楫?dāng)患者咳嗽、咳痰時(shí)，易于產(chǎn)生含有結(jié)核菌氣溶膠，感染周圍人群機(jī)率較高，故采集痰標(biāo)本時(shí)應(yīng)在遠(yuǎn)離人群開放空間進(jìn)行，或在通風(fēng)良好室內(nèi)進(jìn)行?；颊吡羧√禈?biāo)本，應(yīng)由檢驗(yàn)人員或經(jīng)培訓(xùn)專員目視檢驗(yàn)標(biāo)本質(zhì)量（尤其是用于首次診療痰標(biāo)本）。合格痰標(biāo)本應(yīng)是患者深呼吸后，由肺部深處咳出分泌物，標(biāo)本量通常在3～5ml。干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色（或奶酪色）、膿樣、團(tuán)塊狀肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時(shí)較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發(fā)覺大量膿性炎癥細(xì)胞、肺上皮脫落細(xì)胞。因?yàn)檫@類標(biāo)本是由肺部深處咳出，對(duì)肺結(jié)核診療最有價(jià)值，故AFB檢出率較高。血痰：這類標(biāo)本是因粘液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰細(xì)胞特征外，含新鮮血液標(biāo)本中可見到被染色血細(xì)胞。因?yàn)楹獦?biāo)本易干擾AFB鏡檢結(jié)果，故在制片時(shí)應(yīng)盡可能防止挑取含血標(biāo)本。粘液痰：標(biāo)本外觀以白色、粘稠度較高肺部和支氣管分泌物為主，制片時(shí)需仔細(xì)涂抹；涂片染色后鏡檢時(shí)，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞（細(xì)胞較長(zhǎng)且形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色均較深，細(xì)胞一端可見著色較淺纖毛），伴有少許肺上皮脫落細(xì)胞（多數(shù)為圓形、細(xì)胞核較小且著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比大于1:3）、膿性炎癥細(xì)胞（卵圓形、細(xì)胞核占細(xì)胞百分比較大且著色較深，核質(zhì)比低于1:1）、口腔脫落細(xì)胞及口腔寄生菌。這類標(biāo)本AFB檢出率較唾液高。唾液：目視觀察標(biāo)本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時(shí)伴有氣泡；涂片染色鏡檢時(shí)，鏡下可見少許口腔上皮脫落細(xì)胞（形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比靠近或大于1:2）和口腔內(nèi)寄生菌，有時(shí)可見食物殘?jiān)Ｒ驗(yàn)檫@類標(biāo)本進(jìn)行AFB檢驗(yàn)時(shí)檢出率很低，用于對(duì)患者確定診療時(shí)是不合格標(biāo)本。合格痰標(biāo)本通常為干酪痰、褐色血痰或含少許新鮮血液血痰、粘液痰。痰標(biāo)本不合格時(shí)，應(yīng)深入指導(dǎo)并要求病人重新送檢。進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)在登記本和檢驗(yàn)匯報(bào)單上注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時(shí)參考。直接涂片檢驗(yàn)檢驗(yàn)對(duì)象依照檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)分為兩類：確定診療，發(fā)覺傳染源；療效評(píng)價(jià)，作為確定化療方案和治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。（1）確定診療：凡因結(jié)核病癥狀求診及轉(zhuǎn)診可疑肺結(jié)核患者，均應(yīng)進(jìn)行痰涂片檢驗(yàn)。確定診療涂片檢驗(yàn)應(yīng)采集3個(gè)合格痰標(biāo)本。就診當(dāng)初在門診留一份“即時(shí)痰”標(biāo)本，同時(shí)給患者2個(gè)痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗(yàn)。（2）療效評(píng)價(jià)：凡已確診、登記、治療肺結(jié)核患者，在化療期間按照要求應(yīng)定時(shí)查痰：①初治涂陽(yáng)患者在療程強(qiáng)化期末、繼續(xù)期滿3個(gè)月和繼續(xù)期結(jié)束時(shí)（通常為治療后第2、5和6個(gè)月）；復(fù)治涂陽(yáng)患者在療程強(qiáng)化期末、繼續(xù)期滿3個(gè)月和繼續(xù)期結(jié)束時(shí)（通常為治療后第2、5和8個(gè)月）分別搜集一份晨痰和即時(shí)痰進(jìn)行涂片檢驗(yàn)。②初、復(fù)治涂陽(yáng)患者在療程強(qiáng)化期結(jié)束時(shí)，痰菌仍為陽(yáng)性者，應(yīng)在1個(gè)月時(shí)增加痰涂片檢驗(yàn)一次；若復(fù)治涂陽(yáng)患者治療滿3個(gè)月時(shí)痰菌仍陽(yáng)性，應(yīng)在治療滿5個(gè)月增加痰涂片檢驗(yàn)一次。③確診、登記涂陰肺結(jié)核患者，即使患者因故未接收治療，也應(yīng)在登記后滿2和6個(gè)月時(shí)進(jìn)行痰菌檢驗(yàn)（一）玻片制備1、用于抗酸菌（AFB）檢驗(yàn)載玻片要求（1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。（2）每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片檢驗(yàn)。（3）應(yīng)使用以95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無(wú)油污、無(wú)劃痕新載玻片制備涂片，在玻片反面一端1/3處注明試驗(yàn)室序號(hào)及標(biāo)本序號(hào)（如使用載玻片一端無(wú)磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號(hào)；如使用載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。2、制備涂片（1）小心打開承載痰標(biāo)本容器，預(yù)防產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢。（2）仔細(xì)觀察標(biāo)本，使用折斷竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1ml，于玻片正面右側(cè)2/3處，均勻涂抹成10×20mm卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置自然干燥后（通常約需要30分鐘）進(jìn)行染色鏡檢。（3）涂抹完成后痰標(biāo)本，在結(jié)果匯報(bào)前應(yīng)暫時(shí)保留。（4）為了確保檢驗(yàn)人員安全，禁止在涂抹痰標(biāo)本同時(shí)，對(duì)載玻片進(jìn)行加熱。（二）染色1、萋爾－尼爾遜染色法（Ziehl-Neelson），簡(jiǎn)稱萋尼氏染色法（Z-N）（1）試劑配制：①石碳酸復(fù)紅染色液：堿性復(fù)紅儲(chǔ)存液：堿性復(fù)紅8g加95%酒精至100ml，充分振蕩使復(fù)紅溶解。5%石碳酸水溶液：40-50℃水浴加熱石碳酸使之融解，取5g石碳酸復(fù)紅工作液：10ml經(jīng)定性濾紙過濾堿性復(fù)紅儲(chǔ)存液與90ml5%石碳酸水溶液充分振蕩、混合均勻后，使用定性濾紙過濾。②5%鹽酸乙醇脫色液：5ml濃鹽酸（35%）與95ml95%乙醇混合。③亞甲蘭復(fù)染液：儲(chǔ)存液：0.3g亞甲蘭溶于50ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。亞甲蘭復(fù)染液：以蒸餾水3倍稀釋0.3%亞甲蘭儲(chǔ)存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲蘭終濃度為0.1%。使用定性濾紙過濾，即得亞甲蘭復(fù)染液。（2）染色步驟：①涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上距離；火焰固定（在5秒鐘內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。②滴加石碳酸復(fù)紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應(yīng)一直保持痰膜被染色液覆蓋，必要時(shí)可續(xù)加染色液。加溫時(shí)勿使染色液沸騰。③流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標(biāo)本上剩下水。④自痰膜上端外緣滴加脫色劑充滿痰膜，脫色3分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無(wú)可視紅色為止。⑤流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩下水。⑥滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液，染色30秒鐘。⑦流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復(fù)染液，然后瀝去標(biāo)本上剩下水。待玻片干燥后鏡檢。⑧一張染色合格玻片，因?yàn)楸粊喖滋m染色而呈亮藍(lán)色。將染色后玻片放置在報(bào)紙上，假如透過痰膜不能分辨報(bào)紙上文字，則表明該玻片涂抹過厚。2、熒光染色法AFB采取熒光染色法鏡檢，只限于那些每日工作量較大（日讀片數(shù)超出25張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員閱讀熒光染色玻片具備豐富經(jīng)驗(yàn)試驗(yàn)室開展。（1）試劑配制：①染色劑（金胺O染液）：金胺O▲ 1 g石碳酸 50 ml乙醇 100 ml補(bǔ)蒸餾水至 1000 ml▲金胺O（auramineO，分子式為C17H21N3·HCl）：用于AFB染色時(shí)必須使用最低染料含量約80％生物染色劑。②脫色劑：3%鹽酸乙醇（配制方法參考萋尼氏染色）。③復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。（2）染色步驟：①玻片經(jīng)火焰固定后,滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩下水。②自痰膜上端外緣滴加脫色劑，充滿痰膜，脫色3分鐘或至無(wú)色,流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。③滴加復(fù)染劑復(fù)染2分鐘，瀝去復(fù)染液，自然干燥，準(zhǔn)備鏡檢。（三）鏡檢1、萋尼氏染色玻片鏡檢使用10×目鏡雙目顯微鏡讀片。取染色完成且已干燥玻片，痰膜向上放置在玻片臺(tái)上并以卡尺固定。首先使用40×物鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)卡尺移動(dòng)玻片至痰膜左端，將光線調(diào)整至適當(dāng)亮度，調(diào)整焦距至可見細(xì)胞形態(tài)；移開40×物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100×油鏡進(jìn)行細(xì)致觀察。在淡藍(lán)色背景下，抗酸菌呈紅色；其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。為預(yù)防AFB交叉污染，禁止油鏡鏡頭直接接觸玻片上痰膜。因?yàn)橄惆赜停╟edarwoodimmersionoil）能夠溶解復(fù)紅染料，使萋尼氏染色退色，而且輕易干燥凝結(jié)，對(duì)油鏡頭造成損害；故推薦使用專門用于100×油鏡、不干燥、不變硬鏡油（immersionoil）。讀片時(shí)，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰視野；當(dāng)玻片移動(dòng)至痰膜一端時(shí)，縱向向下轉(zhuǎn)換一個(gè)視野，然后從右向左觀察，依這類推。通常20mm痰膜，使用100×油鏡，每行可觀察約100個(gè)視野。仔細(xì)觀察完300個(gè)視野，通常需要5分鐘以上；每個(gè)工作日，一位鏡檢人員玻片閱讀量不要超出25張，且連續(xù)閱讀10～12張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。2、熒光染色玻片鏡檢玻片放置在玻片臺(tái)上并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進(jìn)行鏡檢，發(fā)覺疑為AFB桿狀熒光顆粒時(shí)，使用40×物鏡確認(rèn)。在暗背景下，抗酸菌發(fā)出桿狀熒光。對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)光線激發(fā)染料產(chǎn)生可視光能力，伴隨時(shí)間而衰減。故熒光染色后涂片應(yīng)于當(dāng)日鏡檢；假如玻片數(shù)量過多，應(yīng)將涂片放置于4℃（四）結(jié)果匯報(bào)1、萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級(jí)匯報(bào)標(biāo)準(zhǔn)抗酸桿菌陰性（－）：連續(xù)觀察300個(gè)不一樣視野，未發(fā)覺抗酸桿菌。匯報(bào)抗酸桿菌菌數(shù)：1～2條抗酸桿菌/300視野?？顾釛U菌陽(yáng)性（1＋）：3～9條抗酸桿菌/100視野。抗酸桿菌陽(yáng)性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野。抗酸桿菌陽(yáng)性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野。抗酸桿菌陽(yáng)性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野。2、熒光染色鏡檢結(jié)果分級(jí)匯報(bào)標(biāo)準(zhǔn)熒光染色抗酸桿菌陰性（-）：0條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性（匯報(bào)抗酸菌數(shù)）：1～3條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性（1+）：