HPLC原理和操作詳解

79C展簡況2三、速率理論(又稱隨機(jī)模型理論)9據(jù)處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)20一、基質(zhì)(擔(dān)體)20代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題26附件：高效液相色譜法(HPLC)復(fù)核細(xì)則28obilephase色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。高效動相，故又稱高壓液相色譜法(HighgraphyHPLCyHSLP此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動相(常用CO)，因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時2間短，特別適用于手性化合物的拆分。阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。(此外還有電泳。)C(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。離原理是根據(jù)離過程是一個吸附－解吸附的平衡過法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體衡過程。是化學(xué)鍵合固定相，如C、C、氨基柱、氰基柱和苯基柱。188色譜法(NPC)和反相色正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。反相色譜法一般用非極性固定相(如C、C)；流動相為水或緩沖液，常188加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時188高~中低~中中~低中~高譜法沒有明顯的界線(如氨基鍵合固定相)。固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離。4．離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被離子對色譜法常用ODS柱(即C)，流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加18mmolLpH。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣提取物、多肽、蛋白譜流出曲線(elutionprofile)。e出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線(高斯Gauss曲線)。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailing?半峰寬(peakwidthathalf-height，W)——峰高一半處的峰寬。h/2W＝2.355σh/22.507σh＝1.064Whh/22．定性參數(shù)(保留值)et0通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。?死體積(deadvolume，V)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測器流動池未被固0定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱固定相顆粒間隙(被流動相占據(jù)，V)、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中m只有V參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這m3部分體積應(yīng)盡量減小。V＝F×t(F為流速)00RRR保留時間。也稱折合保留時間(reducedretentiontime)。在實(shí)驗(yàn)條件(溫RRRRR0RR0RRR柱的分離效率(簡稱柱效)。N取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流R相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。若用調(diào)整保留時間(t')計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(NR有效或N)。eff色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(C、Csm很小)時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。R0上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間(t')是R不保留組分保留時間(t)的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固0定相中不保留，t'＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保Rsmsm于t'、t較V、V易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。R0smr21R0為相對保留時間(《美國藥典》)。12，22增大。但k不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和221)色譜柱存在許多塔板，組分在塔板間隔(即塔板高度)完全服從分配定3)流動相在色譜柱間歇式流動，每次進(jìn)入一個塔板體積。4)在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)(峰高h(yuǎn)和峰面積A)CeC＝ett時，濃度C有極大值，C＝。C就是Rmaxmax色譜峰的峰高。因此上式說明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(即σ一定)，峰高h(yuǎn)與組分的量C(進(jìn)樣量)成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量0一定時，σ越小(柱效越高)，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈由流出曲線方程對V(0~∞)求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×C＝C。max0可見A相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C，因此是常用的定量參數(shù)。把C＝h和W＝2.355σ0maxh/2代入上式，即得A＝1.064×W×h，此為正常峰的峰面積計算公式。h/2率方程(即Giddings方程)：H＝2λd＋＋\s\up5(2p＋\s\up5(2p＋\s\up5(2fp1)渦流擴(kuò)散(eddydiffusion)。由于色譜柱填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A＝2λd，d為填料直徑，pp最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻(λ大)，且會使柱壓過高。大而均勻(球形或近球形)的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小?？偟恼f來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A＝0。2)分子擴(kuò)散(moleculardiffusion)。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u＝2γD/u。mu為流動相線速度，分子在柱的滯留時間越長(u小)，展寬越嚴(yán)重。在低流速mmHPLC只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對D進(jìn)行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的γ＝1。m3)傳質(zhì)阻抗(masstransferresistance)。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜有限的，這一①流動相傳質(zhì)阻抗H＝Cd2pu/D，C為常數(shù)。這是由于在一個流路中流路中mmmm心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動相前移，因而產(chǎn)生峰展②靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗H＝Cd2pu/D，C為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入smsmmsm處于固定相孔穴的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。H對峰展寬的影sm響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻質(zhì)阻力，是H和H都與固定相的粒徑平方d2p成正比，與擴(kuò)散系數(shù)D成反比。因此應(yīng)msmm采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大D，但用有機(jī)溶劑作流動相m時，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。③固定相傳質(zhì)阻抗H＝Cd2fu/D(液液分配色譜)，C為常數(shù)，d為固定液ssssf的液膜厚度，D為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中H與d的平方成正ssf比，在吸附色譜中H與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔s離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，H才有明顯影響。采用單分子層的化s學(xué)鍵合固定相時H可以忽略。s最佳線速度u，在此線速度時，H最小。一般在液相色譜中，u很小(大約optopt0.03~0.1mm/s)，在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。R部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體R柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分(如k＜2)峰形拖尾和峰寬增率越高(N越大)，柱尺寸越小時，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影司)、島津公司等，國有依利特公司、分析儀器廠、分析儀器廠等。流量不穩(wěn)定；螺旋l (RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%)，但出故障的機(jī)會較多(因多一單向閥)，價格也較貴。CATvptePRSD0.1% 求，因?yàn)閴m埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱固體微粒。流動相Milliporem或0.45μm)等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常，以是甲醇或甲醇-水)。瓶的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變：泄壓閥，使泵在較大流量(如5ml/min)下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50ml能是氣泡，需要排除；或者是單向閥有異物，可濾棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(梯度)。且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上)；此外隔膜容易橡。在以峰的始末信號和7725i型最常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好(0.5%)，操作方便。裝液法進(jìn)樣倍(最少3倍)，這樣才能完全置換定量環(huán)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣，，過。球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使最好的使譜帶加寬，這就是色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱(narrowbore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn)，徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱(又稱微柱microcolumn)，徑0.2~0.5mm；④半制備柱(microbore)。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動相；②靈敏度增加；③樣品測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備m柱。流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)。④選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可以烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇(乙腈)沖洗時重復(fù)注射100~200l四氫脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機(jī)物)、甲醇、水依次沖洗。(與柱相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，相同固定相的短柱鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。不敏感)、線性圍寬、重復(fù)性好和適用圍廣。1)按原理可分為光學(xué)檢測器(如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射)、熱學(xué)檢測器(如吸附熱)、電化學(xué)檢測器(如極譜、庫侖、安培)、電學(xué)檢測器(電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率)、放射性檢測器(閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化)以及氫火焰離子化檢測器。2)按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型(又稱選擇性)。通用型檢測器測量3)按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分4)檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速(泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會影響測3)檢測限(detectionlimit)器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測linearrange號與組分量成直線關(guān)系的圍，——有射否小——無是無小難無是有大無是無小難無oletdetector寬，對流速和溫度均不敏收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會提高背景噪音，降低靈敏度(實(shí)際是提高檢測限)。此外，梯度洗脫時，還會產(chǎn)生漂移。A＝lg＝lg＝ECL00路和雙光路兩種?？勺儾ㄩL檢測器又可分單波長(單通道)檢測器和雙波長(雙吸收光譜用于定性(確證是否是單一純物質(zhì))，色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品 (如生物樣品、中草藥)的定性定量分析。1)流動池有氣泡要對流動相進(jìn)行充分的除色譜柱)；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池增壓，然后放2)流動池被污染3)光源燈出現(xiàn)故障要更換光4)倒峰，據(jù)；質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對分離。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±一、基質(zhì)(擔(dān)體)質(zhì)，流動相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析④含碳量及表面覆蓋度(率)。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值。用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖于普通但它可以通過適當(dāng)?shù)墓δ芑菢幽退釅A，但也可以承受耐有機(jī)溶劑+++抗膨脹/收縮+++耐壓+++表面化學(xué)性質(zhì)+++效能++++苯+++++上而形成的固有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上)和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾)。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱封端(或稱封尾、封頂，endcapping些ODS填料是不封尾CH常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH)和二醇基(DIOL)鍵合相。2極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合作反相色譜的固定相。；、還原糖等，因?yàn)樗鼈冎g選好填料(固定相)后，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量④粘度要低(應(yīng)<2cp)。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且醇/水作為沖洗劑時C＝0.32C2甲醇＋0.57C乙腈甲醇C＝0.66C甲醇89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度。采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時，通過測。(噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動)。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒光檢測ml0min方可)，此法不影響溶劑組離線(系統(tǒng)外)脫氣法