基因工程載體構(gòu)建蛋白表達

載體構(gòu)建與蛋白表達原核表達載體構(gòu)建真核表達載體構(gòu)建提高蛋白表達的途徑當(dāng)前第1頁\共有51頁\編于星期五\7點真核細胞與原核細胞的比較

特征原核細胞真核細胞細胞膜有（行使多種功能）有核膜

無

有染色體裸露DNA，無組蛋白DNA與組蛋白結(jié)合核外DNA含有質(zhì)粒DNA線粒體與葉綠體DNA胞質(zhì)區(qū)域化簡單（無細胞器）復(fù)雜有各種細胞器細胞骨架無有（MT、MF、IF）核糖體70S型（30S和50S）80S型（40S和60S）細胞增殖無絲分裂有絲分裂、減數(shù)分裂當(dāng)前第2頁\共有51頁\編于星期五\7點原核細胞與真核細胞的區(qū)別當(dāng)前第3頁\共有51頁\編于星期五\7點原核表達與真核表達的區(qū)別原核基因表達以操縱子形式進行轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時進行真核轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進行，先形成hnRNA,再加工剔除內(nèi)含子，外顯子相連，5’端加帽，3’端加polyA尾巴。翻譯在胞漿的核糖體上進行當(dāng)前第4頁\共有51頁\編于星期五\7點乳糖操縱子學(xué)說(原核基因的表達調(diào)控)當(dāng)前第5頁\共有51頁\編于星期五\7點真核細胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯當(dāng)前第6頁\共有51頁\編于星期五\7點mRNA剪切當(dāng)前第7頁\共有51頁\編于星期五\7點第一節(jié)外源目的基因在原核細胞中的表達原核基因表達載體的構(gòu)成常見的原核細胞表達載體系統(tǒng)外源目的基因在原核細胞中的表達形式在原核細胞中高效表達目的基因當(dāng)前第8頁\共有51頁\編于星期五\7點一、原核基因表達載體的構(gòu)成DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制子:擴增選擇標記：篩選外源基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)啟動子抑制物基因轉(zhuǎn)錄終止子蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)

核糖體結(jié)合位點翻譯起始密碼子翻譯終止密碼子當(dāng)前第9頁\共有51頁\編于星期五\7點啟動子多克隆位點終止子ATGTAA目的基因DNA復(fù)制起始位點耐藥性基因阻遏物基因表達載體當(dāng)前第10頁\共有51頁\編于星期五\7點pBR322

old-style

generalpurposeplasmid4362bp當(dāng)前第11頁\共有51頁\編于星期五\7點DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)

復(fù)制子：包含復(fù)制起始位點（ori)和有關(guān)序列在內(nèi)的DNA片段。常見復(fù)制子有pMB1,p15A,ColE1和pSC101等。前3者為松弛復(fù)制型，含pSC101復(fù)制子的質(zhì)粒載體嚴謹復(fù)制型。

選擇標記：抗生素抗性基因當(dāng)前第12頁\共有51頁\編于星期五\7點

外源基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)

啟動子:能被宿主RNA聚合酶特異識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子具有序列特異性、啟動的方向性、作用的位置特性和種屬特異性。誘導(dǎo)型啟動子：Lac、Trp、Tac等組成型啟動子：T7噬菌體啟動子抑制物基因:其產(chǎn)物是控制啟動子功能的蛋白質(zhì)，對啟動子的起始轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生抑制作用。適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件可使擬制物失活，啟動子功能恢復(fù)。

轉(zhuǎn)錄終止子：終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列。本正終止子：不需要其他蛋白輔助因子，依賴終止信號的終止子：依賴專一蛋白輔助因子（如ρ因子）

防止轉(zhuǎn)錄過頭當(dāng)前第13頁\共有51頁\編于星期五\7點3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)

影響翻譯起始的因素：起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(SD序列)、起始密碼與SD序列之間的距離和堿基組成、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、mRNA上游的5’端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的5’端序列核糖體結(jié)合位點翻譯起始密碼子翻譯終止密碼子當(dāng)前第14頁\共有51頁\編于星期五\7點核糖體結(jié)合位點：原核生物轉(zhuǎn)錄起始位點(RBS)下游的一段DNA序列，由SD序列和起始密碼子組成。SD序列大約3-9bp,位于ATG上游3-11bp處。SD序列可與核糖體16SrRNA特異配對而與宿主核糖體結(jié)合。大腸桿菌SD序列為5’AGGAGG3’，其中GGAG4堿基發(fā)生任何改變均大幅度降低翻譯效率。當(dāng)前第15頁\共有51頁\編于星期五\7點翻譯起始密碼子：一般為ATG(AUG),編碼甲硫氨酸(Met),也有采用其他密碼子。

影響翻譯效率的因素有：SD序列、翻譯起始密碼子、SD序列和翻譯起始密碼子之間的距離和堿基組成等。據(jù)報道，SD序列后面為AAAA或UUUU時，翻譯起始效率最高，而當(dāng)為CCCC或GGGG時效率最低。當(dāng)前第16頁\共有51頁\編于星期五\7點翻譯終止密碼子：它核糖體相遇時，能使核糖體從mRNA模板上脫落，終止翻譯過程。大腸桿菌中多肽鏈的釋放由釋放因子RF1和RF2調(diào)控。RF1識別UAA和UAG,RF2識別UAA和UGA，故選UAA作終止密碼子。可將幾個終止密碼子串聯(lián)。據(jù)悉UAAU為有效終止密碼子。當(dāng)前第17頁\共有51頁\編于星期五\7點二、常見的原核細胞表達載體系統(tǒng)Plac啟動子表達系統(tǒng)PL和PR啟動子表達載體系統(tǒng)T7噬菌體啟動子表達載體系統(tǒng)當(dāng)前第18頁\共有51頁\編于星期五\7點三、外源基因在原核細胞中的表達形式包涵體融合蛋白寡聚型外源蛋白分泌型外源蛋白當(dāng)前第19頁\共有51頁\編于星期五\7點（一）包涵體外源基因的高表達產(chǎn)物在原核細胞中積累，并致密地聚集在一起形成的一種不溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。或許也有一些受體細胞本身的蛋白質(zhì)。包涵體具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象錯誤，故沒有生物學(xué)活性。需要復(fù)性當(dāng)前第20頁\共有51頁\編于星期五\7點（二）融合蛋白定義：將外源目的蛋白的基因與受體菌自身蛋白基因重組，但不改變兩個基因的閱讀框而表達出的蛋白。外源基因宿主基因當(dāng)前第21頁\共有51頁\編于星期五\7點融合蛋白的特點1.穩(wěn)定性好單獨的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被原核細胞中的蛋白水解酶所降解。融合蛋白中，外源蛋白在菌體自身蛋白的引導(dǎo)下，能正確折疊，形成雜合構(gòu)象，封閉了暴露在分子表面的蛋白酶切割位點。當(dāng)前第22頁\共有51頁\編于星期五\7點融合蛋白的特點2.表達效率較高轉(zhuǎn)錄和翻譯由宿主菌的固有設(shè)施控制。3.易于分離純化利用受體菌蛋白的特異性抗體、配體或底物親和層析等技術(shù)，較容易地分離融合蛋白，然后通過蛋白酶水解，特異性裂解外源目的蛋白與受體菌蛋白之間的肽鍵，最終得到外源目的蛋白。當(dāng)前第23頁\共有51頁\編于星期五\7點（三）寡聚型的外源蛋白…多個外源蛋白基因串聯(lián)多表達單元的重組多順反子重組多編碼序列重組當(dāng)前第24頁\共有51頁\編于星期五\7點多表達單元的重組：每個表達單元都含有獨立的啟動子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼。表達分子量較大的蛋白，不需要裂解處理。啟動子相互競爭ABCPromoterSDSDSD當(dāng)前第25頁\共有51頁\編于星期五\7點

多順反子重組：多拷貝的外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止密碼，但轉(zhuǎn)錄在共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子下進行。表達中等外源蛋白。ABCPromoterSDSDSD當(dāng)前第26頁\共有51頁\編于星期五\7點多編碼序列重組：多個基因串聯(lián)，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯起始與終止密碼子，引入蛋白酶酶切位點或可被化學(xué)斷裂的位點。ABCPromoter蛋白酶切位點當(dāng)前第27頁\共有51頁\編于星期五\7點(四)整合型外源蛋白將要表達的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分，而穩(wěn)定遺傳………本質(zhì)為DNA同源交換。待整合的外源基因兩側(cè)必須帶一段與染色體完全同源的的序列。同時將可控的表達元件和選擇性標記基因連接在一起。一般選擇不能自主復(fù)制的質(zhì)粒或溫度敏感型質(zhì)粒。當(dāng)前第28頁\共有51頁\編于星期五\7點（五）分泌型外源蛋白通過運輸或分泌方式穿越細胞外膜進入培養(yǎng)基。需在N端加15-30個氨基酸組成的信號肽序列。信號肽N端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部氨基酸為疏水性氨基酸。當(dāng)?shù)鞍追置诘酱竽c桿菌細胞內(nèi)外膜之間的外周質(zhì)時，信號肽被信號肽酶切割。當(dāng)前第29頁\共有51頁\編于星期五\7點分泌型表達的優(yōu)點能使蛋白正確折疊分泌到胞外周質(zhì)的蛋白較穩(wěn)定，不易被胞內(nèi)的蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨酸（Met)。簡化了發(fā)酵后處理工藝。缺點：表達量不高，有時信號肽不被切割或切割不當(dāng)。當(dāng)前第30頁\共有51頁\編于星期五\7點四、在原核細胞中高效表達目的基因（一）高效表達外源基因的基本策略（二）目的基因表達水平的提高與檢測當(dāng)前第31頁\共有51頁\編于星期五\7點（一）高效表達外源基因的基本策略載體構(gòu)建的優(yōu)化

選用強啟動子、強終止子使SD序列與核糖體16SrRNA的堿基完全配對調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離防止核糖體結(jié)合位點附近序列轉(zhuǎn)錄后的mRNA形成二級結(jié)構(gòu)提高稀有密碼子的表達頻率通過點突變方法改造外源基因的稀有密碼構(gòu)建基因高表達受體菌大腸桿菌缺乏翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性當(dāng)前第32頁\共有51頁\編于星期五\7點提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性采用分泌型表達系統(tǒng)表達為融合蛋白構(gòu)建包涵體表達系統(tǒng)選用蛋白酶缺陷型菌株作為受體菌外源蛋白中對水解酶敏感的序列進行修飾和改造當(dāng)前第33頁\共有51頁\編于星期五\7點（二）目的基因表達水平的提高與檢測采用定點誘變技術(shù)，使核糖體結(jié)合位點(SD序列，起始密碼子ATG)的周圍堿基發(fā)生改變，去除該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)，以便提高基因表達水平。利用不同表達水平的宿主菌株在目的基因DNA下游接一段DNA序列，可以穩(wěn)定mRNA從而提高翻譯效果。通過改變溫度、核糖體結(jié)合位點、啟動子強度、質(zhì)粒拷貝數(shù)或誘導(dǎo)物的量當(dāng)前第34頁\共有51頁\編于星期五\7點目的基因表達產(chǎn)物的檢測SDS和放射自顯影當(dāng)前第35頁\共有51頁\編于星期五\7點第二節(jié)外源目的基因在真核細胞中的表達真核表達載體的功能元件酵母表達系統(tǒng)當(dāng)前第36頁\共有51頁\編于星期五\7點真核表達載體的功能元件啟動子元件增強子元件加Poly(A)信號剪接信號與翻譯相關(guān)的元件當(dāng)前第37頁\共有51頁\編于星期五\7點增強子元件增強子：能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列?？梢栽谵D(zhuǎn)錄起始位點上游或與啟動子相距較遠的位置上起作用。可以將幾個增強子串聯(lián)使用，從而大幅度提高啟動子的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)前第38頁\共有51頁\編于星期五\7點二、酵母表達系統(tǒng)酵母基因表達載體的組成元件酵母基因表達載體的類型表達外源基因的酵母宿主菌當(dāng)前第39頁\共有51頁\編于星期五\7點酵母基因表達載體的組成元件DNA復(fù)制起始序列選擇（篩選）標記啟動子分泌信號序列終止子有絲分裂穩(wěn)定區(qū)當(dāng)前第40頁\共有51頁\編于星期五\7點啟動子長度約1-2kb。其上游有各種調(diào)控序列，例如上游激活序列、上游阻遏序列、組成型啟動子序列等。啟動子下游有轉(zhuǎn)錄起始位點和TATA序列。TATA序列可被轉(zhuǎn)錄因子蛋白識別、結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。強啟動子：酵母磷酸甘油酯激酶(PGK)、甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)基因啟動子等當(dāng)前第41頁\共有51頁\編于星期五\7點分泌信號序列分泌信號序列引導(dǎo)分泌蛋白從胞內(nèi)到胞外，并對蛋白質(zhì)翻譯后加工起作用。有α-因子前導(dǎo)肽序列，蔗糖酶信號肽序列，酸性磷酸酯酶信號肽序列等。其中釀酒酵母α-因子prepro信號序列最經(jīng)典。理論上，可將外源基因與其天然信號序列、釀酒酵母α-因子前導(dǎo)肽或畢赤酵母酸性磷酸酶信號肽等任意一種結(jié)合共閱讀框融合，構(gòu)建分泌型表達質(zhì)粒。當(dāng)前第42頁\共有51頁\編于星期五\7點酵母基因表達載體的類型自主復(fù)制型質(zhì)粒載體整合型質(zhì)粒載體著絲粒型質(zhì)粒載體酵母人工染色體當(dāng)前第43頁\共有51頁\編于星期五\7點表達外源基因的酵母宿主菌釀酒酵母高密度培養(yǎng)產(chǎn)生乙醇積累，限制了酵母的繼續(xù)生長和蛋白分泌巴斯德畢赤酵母甲醇營養(yǎng)菌，甲醇可誘導(dǎo)與甲醇代謝相關(guān)酶基因的高效表達，如AOX1的表達產(chǎn)物可在細胞中高水平積累。當(dāng)前第44頁\共有51頁\編于星期五\7點YeastExpressionSystem30yearsago,KoichiOgatadiscoveredsomeyeastcouldliveusingcarbinalassolecarbonsource.ThepromoterofAOX1canbeactivatedstronglybycarbinal.WhereasthatofAOX2canonlybeweeklyelicited.So,theformerwasemployedwidelyinlabresearchandindustrialscaleup.當(dāng)前第45頁\共有51頁\編于星期五\7點以AOX1為啟動子，以AOX1基因缺失突變體為受體細胞，可高效表達外源基因。或用組氨酸脫氫酶突變體作為受體細胞，從而對攜帶his標記基因的轉(zhuǎn)化子進行篩選。還有蛋白酶缺陷宿主菌當(dāng)前第46頁\共有51頁\編于星期五\7點巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點優(yōu)點：與釀酒酵母相比，產(chǎn)酒精較少適合高密度培養(yǎng)由于培養(yǎng)基pH較低并含有甲醇，不易污染分泌外源蛋白能力較強，而自身蛋白較少，故易于純化缺點：氧氣的