解磷菌篩選方案

一、培養(yǎng)基1、無(wú)機(jī)磷發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g,(NH4)2SO40.5g,MgSO4?H2O0.3g,NaCI0.3g,KCl0.3g,FeSO4?7H2O0.03g,MnSO4HO0.03g,磷礦粉5g,調(diào)節(jié)pH到7.0--7.2蒸餾水1000mL.磷礦粉2與其他藥品分開滅菌后混合.2、無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基無(wú)機(jī)磷發(fā)酵培養(yǎng)基中加人瓊脂粉18--20g，用于斜面保藏及平板培養(yǎng)3、種子液培養(yǎng)基無(wú)機(jī)磷發(fā)酵培養(yǎng)基中磷礦粉用0.5gK2HPO4替代.二、耐低溫解磷菌篩選方法1、初篩在0和10°C時(shí)各取樣品5g，放入250mL錐形瓶中，加95mL無(wú)菌水和玻璃珠，150r/min室溫振蕩30min,制備成母液。采用梯度稀釋法，將母液稀釋至10-7-10-1倍，并分別用無(wú)菌移液槍取0.2mL接種于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板中，涂布均勻，待接種液被培養(yǎng)基吸收后,倒置培養(yǎng)于對(duì)應(yīng)溫度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，進(jìn)行低溫培養(yǎng),周期為5d?以相同濃度接種液培養(yǎng)的菌落數(shù)、菌落直徑及其周圍出現(xiàn)溶磷圈大小作為判斷解磷強(qiáng)弱的指標(biāo).篩選得到的耐低溫解磷菌，經(jīng)純化后斜面保藏.全部操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行2、低溫耐性鍛煉將得到的菌株接種于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板中，在初篩溫度下培養(yǎng)24h后，降低1°。進(jìn)行耐低溫馴化，7d為1個(gè)馴化周期，每個(gè)周期結(jié)束后，培養(yǎng)溫度再降低1°c.如降低培養(yǎng)溫度后解磷菌仍能生長(zhǎng)，則進(jìn)行若干周期的適應(yīng)性低溫馴化，周期數(shù)視菌種馴化情況而定，然后進(jìn)行下一階段耐低溫馴化攻口果降低培養(yǎng)溫度后菌株不能正常生長(zhǎng)，則在原培養(yǎng)溫度和降低溫度間進(jìn)行反復(fù)馴化，直到篩選出耐低溫突變株.3、低溫條件下解磷菌解磷能力測(cè)定分別將斜面保藏的各目的菌株活化,接種于種子培養(yǎng)基，0--10°C（篩選溫度）培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，120r/min振蕩48h?菌株濃度達(dá)到108CFU/ml后備用.設(shè)接種和不接種培養(yǎng)基2種處理，每種處理5個(gè)平行.接種處理中將各種子液按照5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同上，周期7d然后進(jìn)行p（可水溶性磷），p（可微生物量磷）和pH測(cè)定。p（可水溶性磷）的測(cè)定：將各菌株發(fā)酵液于6000r/min離心15min，取上清液，鑰銻抗比色法測(cè)定.離心后所得菌體保留備用。p（微生物量磷）的測(cè)定：將上述得到的菌體用無(wú)菌水反復(fù)沖洗、離心，充分洗去菌體表面粘附的發(fā)酵液，于121C滅活30min得到的純凈菌體加適量濃硫酸消煮至棕黑色加30%的H2O2數(shù)滴，繼續(xù)消煮至清亮，以釋放出微生物量磷。消煮液定容后，用釩鑰黃比色法測(cè)定p（微生物量磷）。鑰銻抗比色法、釩鑰黃比色法參照農(nóng)化分析書。4、溫度適應(yīng)性將馴化后得到的解磷菌制備成種子液，梯度稀釋后，從適當(dāng)濃度的稀釋液中取0.2mL菌懸液涂布于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板中，分別0、1、2、3、4、5、6、8、10°C下倒置培養(yǎng)5d,觀察結(jié)果.解磷菌菌種的鑒定透射電鏡觀察,(菌株B25菌體細(xì)胞桿狀、末端方成短鏈、中生、抱囊無(wú)明顯膨大革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)莢膜、菌落大、扁平初步認(rèn)為是芽抱類菌屬).采用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步對(duì)解磷細(xì)菌進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定，即提取解磷菌的基因組DNA并對(duì)其核糖體的16SrRNA保守型序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收、克隆、測(cè)序并用DNAStar分析軟件將其序列與GenBank中近緣種序列進(jìn)行同源性比對(duì)。[1].ChineseJournalofAppliedEcology,Jan.2012,23(1):235-239⑵?李鳴曉等.耐高溫解磷菌的篩選及解磷能力研究?環(huán)境科學(xué)研究.第21卷第3期,2008.魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2000..趙小蓉，林啟美.微生物解磷的研究進(jìn)展[