第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理

當(dāng)前第1頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)點高度的靈敏性高度的特異性當(dāng)前第2頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫分析技術(shù)的應(yīng)用常用的診斷技術(shù)血凝試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗?zāi)z體金免疫技術(shù)放射免疫分析技術(shù)當(dāng)前第3頁\共有84頁\編于星期五\21點凝集試驗概念：顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。1.直接凝集反應(yīng)抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。①玻片直接凝集法：定性試驗②試管直接凝集法：半定量試驗當(dāng)前第4頁\共有84頁\編于星期五\21點試管法半定量試驗+

玻片直接凝集試驗1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512當(dāng)前第5頁\共有84頁\編于星期五\21點2.間接凝集法先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上(如RBC,乳膠顆粒)，再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。臨床常用的有間接血凝試驗、乳膠凝集試驗等。+→待檢樣品抗原吸附血球或乳膠顆粒反應(yīng)凝集物當(dāng)前第6頁\共有84頁\編于星期五\21點3.間接凝集抑制試驗先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng)，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。例：乳膠凝集抑制試驗檢測HCG(妊娠診斷)步驟1：將已知抗體與待檢標(biāo)本混勻＋＋步驟2：加入抗原吸附的乳膠顆?；靹蚩乖饺槟z顆粒結(jié)果判斷：不凝集為陽性結(jié)果已知抗體待檢標(biāo)本當(dāng)前第7頁\共有84頁\編于星期五\21點凝集反應(yīng)當(dāng)前第8頁\共有84頁\編于星期五\21點2.沉淀反應(yīng)

概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應(yīng)。類型：★單向免疫擴散★免疫比濁法★雙向免疫擴散★對流免疫電泳當(dāng)前第9頁\共有84頁\編于星期五\21點

單向瓊脂擴散試驗當(dāng)前第10頁\共有84頁\編于星期五\21點雙向瓊脂擴散試驗當(dāng)前第11頁\共有84頁\編于星期五\21點

對流免疫電泳當(dāng)前第12頁\共有84頁\編于星期五\21點測吸光度計算抗原或抗體的含量抗體抗原免疫復(fù)合物的濃度與透射光的衰減呈正相關(guān)免疫比濁法原理當(dāng)前第13頁\共有84頁\編于星期五\21點3.中和反應(yīng)如抗“O”試驗4.免疫標(biāo)記技術(shù)概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。常用方法有免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫檢測技術(shù)等。特點：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。當(dāng)前第14頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫標(biāo)記技術(shù)酶免疫標(biāo)記技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)免疫金標(biāo)記技術(shù)當(dāng)前第15頁\共有84頁\編于星期五\21點酶聯(lián)免疫吸附試驗1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)當(dāng)前第16頁\共有84頁\編于星期五\21點酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).當(dāng)前第17頁\共有84頁\編于星期五\21點酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

當(dāng)前第18頁\共有84頁\編于星期五\21點2、標(biāo)記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法當(dāng)前第19頁\共有84頁\編于星期五\21點戊二醛交聯(lián)法(一步法）抗體-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶當(dāng)前第20頁\共有84頁\編于星期五\21點戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶當(dāng)前第21頁\共有84頁\編于星期五\21點過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)當(dāng)前第22頁\共有84頁\編于星期五\21點標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離酶方法：鹽析、柱層析2、鑒定抗體活性酶活性標(biāo)記物純度當(dāng)前第23頁\共有84頁\編于星期五\21點ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

當(dāng)前第24頁\共有84頁\編于星期五\21點當(dāng)前第25頁\共有84頁\編于星期五\21點（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原當(dāng)前第26頁\共有84頁\編于星期五\21點獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定當(dāng)前第27頁\共有84頁\編于星期五\21點

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法當(dāng)前第28頁\共有84頁\編于星期五\21點酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA-間接法)當(dāng)前第29頁\共有84頁\編于星期五\21點包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定當(dāng)前第30頁\共有84頁\編于星期五\21點（三）競爭法

此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。當(dāng)前第31頁\共有84頁\編于星期五\21點用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標(biāo)本中待測抗原含量當(dāng)前第32頁\共有84頁\編于星期五\21點對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。當(dāng)前第33頁\共有84頁\編于星期五\21點飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測當(dāng)前第34頁\共有84頁\編于星期五\21點河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：當(dāng)前第35頁\共有84頁\編于星期五\21點食源性病原菌檢測試劑盒大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡萄球菌

當(dāng)前第36頁\共有84頁\編于星期五\21點轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質(zhì)．肉制品的摻假檢測：以辣根過氧化物酶標(biāo)記不同動物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為1%時即可檢出食品其他檢測：當(dāng)前第37頁\共有84頁\編于星期五\21點熒光抗體技術(shù)的原理與方法

用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的IC可散發(fā)出熒光，對標(biāo)本中的抗原或抗體進行測定和定位。常用的熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。常用的方法直接熒光法間接熒光法當(dāng)前第38頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫熒光技術(shù)當(dāng)前第39頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫熒光技術(shù)——直接法Ag熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片當(dāng)前第40頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫熒光技術(shù)——間接法Ag熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片待測抗體當(dāng)前第41頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫熒光技術(shù)當(dāng)前第42頁\共有84頁\編于星期五\21點熒光顯微鏡當(dāng)前第43頁\共有84頁\編于星期五\21點熒光顯微鏡使用原理激發(fā)濾片（BG）吸收濾片（OG）標(biāo)本FITC吸收光峰值：490-495nmFITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650當(dāng)前第44頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫金標(biāo)記技術(shù)免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。當(dāng)前第45頁\共有84頁\編于星期五\21點一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。當(dāng)前第46頁\共有84頁\編于星期五\21點

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量當(dāng)前第47頁\共有84頁\編于星期五\21點膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)當(dāng)前第48頁\共有84頁\編于星期五\21點膠體金結(jié)合物（Conjugate）當(dāng)前第49頁\共有84頁\編于星期五\21點一、免疫滲濾測定(IFA)當(dāng)前第50頁\共有84頁\編于星期五\21點

斑點滲漏法

其原理與層析法相類同，中心圓點為一株單抗，邊上小點為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點，洗去未結(jié)合抗原，再滴加金標(biāo)另一株單抗，若有抗原則形成金-Ab-Ag?薄膜的紅色斑點，而邊上是金-Ab-Ab2?薄膜的質(zhì)控點，是為金標(biāo)二步法。

當(dāng)前第51頁\共有84頁\編于星期五\21點IFA——雙抗體夾心法測抗原AB當(dāng)前第52頁\共有84頁\編于星期五\21點IFA——結(jié)果判斷當(dāng)前第53頁\共有84頁\編于星期五\21點二、免疫層析測定（ICA）當(dāng)前第54頁\共有84頁\編于星期五\21點層析法將金標(biāo)的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標(biāo)單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應(yīng)抗原，既形成Ag-Ab-金復(fù)合物，當(dāng)上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來，顯示陽性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標(biāo)單抗上行此處即被固定下來，作為金標(biāo)單抗質(zhì)控的提示。此種方法稱金標(biāo)一步法。當(dāng)前第55頁\共有84頁\編于星期五\21點

兔抗鼠IgG鼠抗HCG單抗金標(biāo)鼠抗HCG單抗尿液浸濕標(biāo)志線手持端斑點金免疫層析試驗（一）當(dāng)前第56頁\共有84頁\編于星期五\21點斑點金免疫層析試驗（二）尿樣陽性弱陽性陰性無效質(zhì)控線測試線當(dāng)前第57頁\共有84頁\編于星期五\21點

ICA——雙抗體夾心法測抗原當(dāng)前第58頁\共有84頁\編于星期五\21點ICA---競爭法測抗原免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖當(dāng)前第59頁\共有84頁\編于星期五\21點ICA竟?fàn)幏ńY(jié)果觀察

陰性陽性無效當(dāng)前第60頁\共有84頁\編于星期五\21點ICA——間接法測抗體當(dāng)前第61頁\共有84頁\編于星期五\21點ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效當(dāng)前第62頁\共有84頁\編于星期五\21點IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深當(dāng)前第63頁\共有84頁\編于星期五\21點IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）當(dāng)前第64頁\共有84頁\編于星期五\21點1、羅立新,繆瓏,潘力,等.快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(2):154-156.2、賴衛(wèi)華,熊勇華,陳高明,等.應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究[J].食品科學(xué),2005,26(5):204-207.當(dāng)前第65頁\共有84頁\編于星期五\21點3、諶志強,段惠莉,王新為,等.大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(4):705-706.4、謝昭聰,宋志強,呂敬章,等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2005,28(3):163-165.當(dāng)前第66頁\共有84頁\編于星期五\21點5、王中民,李君文,王新為,等.免疫金滲濾試驗檢測食品中沙門氏菌的研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2001,29(4):45-47.6、劉永德,汪毅,陳禹雷,免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2005,23(3):321-324.當(dāng)前第67頁\共有84頁\編于星期五\21點斑點金免疫滲濾試驗ADCB陰性（未懷孕）陽性（懷孕）加尿樣除去濾器加膠體金標(biāo)記抗體加洗滌液結(jié)果判定當(dāng)前第68頁\共有84頁\編于星期五\21點免疫印跡法圖解SDS裂解病毒聚丙酰胺凝膠電泳-+95684512KD電轉(zhuǎn)印至NC膜上置待測血清中，漂洗；加酶標(biāo)抗抗體，漂洗；加底物顯色1204124KD當(dāng)前第69頁\共有84頁\編于星期五\21點

第四節(jié)放射性核素標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化當(dāng)前第70頁\共有84頁\編于星期五\21點R：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物，而探測待測物上的標(biāo)記信號(標(biāo)記物的放大效應(yīng))I：免疫學(xué)反應(yīng)高特異廢除以往沿用的無機或有機試劑，代之以抗體為結(jié)合劑當(dāng)前第71頁\共有84頁\編于星期五\21點常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、125I的標(biāo)記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）當(dāng)前第72頁\共有84頁\編于星期五\21點直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T當(dāng)前第73頁\共有84頁\編于星期五\21點間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP當(dāng)前第74頁\共有84頁\編于星期五\2