DB14∕T 1804-2019 豬流行性腹瀉病毒抗體ELISA 檢測(cè)方法

11.220B

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1804—2019豬流行性腹瀉病毒抗體

檢測(cè)方法

發(fā)布

實(shí)施山西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)

布DB14/

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1804—2019 前言

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II1

范圍

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12

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13 實(shí)驗(yàn)原理

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14 實(shí)驗(yàn)條件

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15 實(shí)驗(yàn)方法

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16 結(jié)果判定

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27 注意事項(xiàng)

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3附錄

A（規(guī)范性附錄） 試劑配制方法....................................................

4DB14/

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1804—2019

ELISA

1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中豬流行性腹瀉病毒抗體方法的縮略語、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性腹瀉病毒抗體的檢測(cè)。2 縮略語ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme

immunosorbent

assay）。OD：光密度值(optical

density)。HRP：辣根過氧化物酶(horseradish

。3 實(shí)驗(yàn)原理本標(biāo)準(zhǔn)采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（間接ELISA），該方法利用抗原抗體反應(yīng)具有特異性的特點(diǎn)，將特異性的豬流行性腹瀉病毒S蛋白包被固相載體酶標(biāo)板，加入待檢血清后，如果樣品中含有豬流行性腹IgG-HRP相應(yīng)的抗體量成正比，可借助OD450nm值的大小進(jìn)行定性判斷。4 實(shí)驗(yàn)條件4.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)驗(yàn)操作在15

℃～

℃下進(jìn)行。未滅活的感染性材料的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.2 儀器Ⅱ級(jí)生物安全柜、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒溫箱。5 實(shí)驗(yàn)方法5.1 實(shí)驗(yàn)材料豬流行性腹瀉病毒S液、封閉液。試劑配制方法見附錄A。5.2 樣品準(zhǔn)備DB14/

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1804—2019取動(dòng)物全血，待血液充分凝固后，4

r/min離心10

min，收集血清。也可等凝固后自然析出血清。血清應(yīng)清亮，無溶血。樣品處理過程中應(yīng)防止樣品的污染，注意個(gè)人安全防護(hù)。5.3 包被用包被液將包被抗原稀釋至工作濃度

μg/mL，加至抗原包被板中，每孔

μL，2

℃～8

℃包被

h。5.4 封閉

μL

℃±1

℃孵育2

h37

℃±1

℃干燥2

h。5.5待檢血清的稀釋待檢血清在血清稀釋板中按40倍稀釋。5.6 操作步驟5.6.1 加樣1μL1237℃±1℃下溫育45

。5.6.2 洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200

μL，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。5.6.3 加酶標(biāo)抗體1:5

000100

μL，37

℃±1

℃放置30

min。5.6.4 洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200

μL，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。5.6.5 加底物液每個(gè)反應(yīng)孔加入底物液

μL，置20

℃～25

℃下避光顯色10

min。5.6.6 加終止液每孔加終止液50

μL，10

min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定450

nm波長處的吸光度（OD6 結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件：陽性對(duì)照OD450nm值≥0.8，陰性對(duì)照OD450nm<0.25。若被檢樣品（S-N）≥0.2，該樣品判為豬流行性腹瀉病毒抗體陽性；若被檢樣品（S-N）/(P-N)<0.2該樣品判為豬流行性腹瀉病毒抗體陰性。DB14/

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1804—2019S=樣品孔OD450nm值，N=陰性對(duì)照孔平均OD450nm值，P=陽性對(duì)照孔平均OD450nm值。7 注意事項(xiàng)7.1 人員防護(hù)樣品處理及實(shí)驗(yàn)過程中注意做好個(gè)人的安全防護(hù)工作。7.2 樣品處理血清應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜中析出。7.3 廢棄物處理操作區(qū)應(yīng)有專門的固體和液體廢棄物收集容器，廢棄物經(jīng)高壓滅菌后按相關(guān)規(guī)定處理。DB14/

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1804—2019AA附

錄 A（規(guī)范性附錄）試劑配制方法A.1 包被液包被液為碳酸鹽緩沖液（0.025

mol/L，pH

）。將下列試劑按序加入1

mL規(guī)格的容器中，加800

mL蒸餾水充分溶解，定容至1

000

mL。碳酸鈉（Na2CO3） 1.59

g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93

g加蒸餾水至 1

000

mLA.2 洗滌液氯化鈉（NaCl）

g氯化鉀（）

g十二水磷酸氫二鈉（Na24?12H2O） 2.9

g磷酸二氫鉀（KH2PO4）

gTween-20

加蒸餾水至 1

000

mLA.3 底物液商品化TMB顯色液。A.4 終止液98%濃硫酸（H24） 108.8

mL加蒸餾水至1

000

mLA.5 樣品稀釋液氯化鈉（NaCl）

g氯化鉀（）

g十二水磷酸氫二鈉（Na24?12H2O） 2.9

g磷酸二氫鉀（KH2PO4）

g加蒸餾水至 1

000

mLA.6封閉液牛血清白蛋白（BSA）

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