高效液相色譜法-課程課件

6.高效液相色譜法《儀器分析》精品課程組6.1概述6.2高效液相色譜儀一、高效液相色譜法簡介高效液相色譜法起源于經(jīng)典液相色譜法，它是現(xiàn)代分析化學(xué)中最重要的分離分析方法之一。直到20世紀(jì)60年代后期，才產(chǎn)生了具有現(xiàn)代意義的高效液相色譜。高效液相色譜是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。二、液相色譜分離原理及分類

和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相，即固定相和流動相組成。

被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。

按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)（分離機理）的不同，液相色譜可分為：分配色譜：——分配系數(shù)吸附色譜：——吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜（體積排阻色譜）：——分子大小而引起的體積排阻三、高效液相色譜法的特點

高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物，以及生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜法比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用?。籋PLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。高效液相色譜與氣相色譜法比較9.2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀是實現(xiàn)液相色譜分析的儀器設(shè)備，自1967年問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱以及高靈敏的檢測器，實現(xiàn)了對樣品的高速、高效和高靈敏的分離測定。高效液相色譜法的分析流程一、高壓輸液系統(tǒng)貯液器作用：提供足夠數(shù)量的符合要求的流動相以完成分析任務(wù)。要求（1）必須具有足夠的容積；（2）脫氣方便；（3）能耐一定的壓力；（4）所用材質(zhì)對所使用的溶劑都是惰性的。注意（1）溶劑在放入貯液罐之前，必須經(jīng)過濾膜過濾，以除去溶劑中的機械雜質(zhì)；（2）溶劑在使用前必須脫氣。2.高壓輸液泵作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜分離系統(tǒng)。要求（1）能耐化學(xué)腐蝕；（2）能在高壓下連續(xù)工作；（3）輸出流量穩(wěn)定，無脈沖，重復(fù)性高；（4）適用于梯度洗脫。類型（1）恒壓泵：輸出無脈動，對檢測器噪聲低。但流速不夠穩(wěn)定。（2）恒流泵：泵的內(nèi)體積小，適于梯度洗脫。

3.過濾器在高壓輸液泵的進口和它的出口與進樣閥之間，應(yīng)設(shè)置過濾器。4.梯度洗脫裝置梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。（1）根據(jù)梯度裝置所能提供的流路個數(shù)分為：二元梯度、三元梯度等；（2）依據(jù)溶液混合的方式分為：高壓梯度和低壓梯度。高壓梯度，一般只用于二元梯度。精度很高，易于自動化控制。但必須使用兩臺高壓輸液泵，儀器價格昂貴，故障率亦相對較高。低壓梯度，只需一臺高壓輸液泵，成本低廉，使用方便。二、進樣器進樣器是將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置，要求：密閉性好，死體積小，重復(fù)性好，進樣引起色譜分離系統(tǒng)的壓力和流量波動要小。1.隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。2.高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由定量管控制，因此進樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口泵入溶劑采樣環(huán)進色譜柱進樣3.自動進樣器

由計算機自動控制定量閥，按預(yù)先編好的樣品注射程序進行工作。取樣、進樣、復(fù)位、管路清洗等，可全部自動完成。一次可完成幾十個、上百個樣品的分析。三、色譜柱

擔(dān)負分離作用的色譜柱是色譜儀的心臟。通常要求色譜柱的柱效要高，選擇性要好，分析速度要快。常用分析柱的柱內(nèi)徑一般在2～5mm，也有用內(nèi)徑小于1mm的細柱，柱長一般在15～50cm。

用于半制備或制備目的的色譜柱內(nèi)徑一般在6mm以上。色譜柱的維護使用預(yù)柱保護分析柱。大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2～7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。避免流動相組成及極性的劇烈變化。流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢后將柱子沖洗干凈，并保存于乙腈中。壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。四、檢測器1.作用將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號，以完成定性、定量分析的任務(wù)。2.分類（1）通用型檢測器如折光指數(shù)（示差折光）檢測器、電導(dǎo)檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器等。（2）專用型如紫外檢測器、熒光檢測器、安培檢測器等。3.對檢測器的要求（1）具有高靈敏度和可預(yù)測的響應(yīng)，響應(yīng)線性范圍寬；（2）對樣品中所有組分都有響應(yīng)，適用范圍廣，響應(yīng)速度快；（3）溫度和流動相流速的變化對響應(yīng)沒有影響；（4）響應(yīng)與流動相的組成無關(guān)，可作梯度洗脫；（5）死體積小，不造成柱外譜帶擴展；（6）使用方便、可靠、耐用、易清洗和維修；（7）不破壞樣品組成；（8）能對被檢測的峰提供定性和定量信息。4.紫外檢測器紫外檢測器是目前液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測器。在HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣，幾乎所有的液相色譜裝置中都配有紫外檢測器。紫外檢測器實際上是一個紫外光度計，有分光（可變波長式）與不分光（固定波長式）兩種。

紫外檢測器結(jié)構(gòu)簡單，應(yīng)用范圍光，具有很高的靈敏度，檢測限可達10-9g/mL，此外，該檢測器對溫度和流速變化不敏感，可用于梯度洗提。缺點在于：不適用于對紫外光完全不吸收的試樣，且溶劑的選擇受限制（對紫外光有吸收的溶劑不能使用）。5.示差折光檢測器

示差折光檢測器為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。其主要缺點是：對溫度變化敏感，故檢測器的控溫精度應(yīng)在±10-3℃。且該檢測器不適于梯度洗提。6.

光電二極管陣列檢測器（PDA）光電二極管陣列檢測器一般認為是目前液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測器。光電二極管陣列檢測