血涂片的制備與染課件

血涂片的制備與染色

血涂片血涂片的顯微鏡檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法血片制備和染色不良,常使細(xì)胞鑒別發(fā)生困難,甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論血涂片的制備與染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆掌胀ㄊ止ぶ苽溲科姆椒ㄕ莆杖鹗先玖系奶匦院腿旧椒叭鹗?吉姆薩復(fù)合染色方法

血涂片的制備實(shí)驗(yàn)器材：

EDTA-K2抗凝血、推片、載玻片（25mm*75mm,厚度為0.8～1.2mm)

載玻片的清潔要求：清潔、干燥、中性、無油膩新載玻片用1mol/LHCL浸泡24小時(shí)→用清水徹底沖洗→烘干備用。用過的玻片放入肥皂水或洗衣粉水中煮沸20分鐘，再用熱水將肥皂和血膜洗凈，用清水反復(fù)沖洗后烘干備用。

制作血涂片的標(biāo)本末梢血EDTA-K2抗凝靜脈血操作1.采血2.推片左手持載玻片，右手持推片，在玻片近一端1/3處，加一滴（約0.05ml)充分混勻的血液，握住另一張邊緣光滑的推片，以30°～45°角使血滴沿推片迅速散開，快速、平穩(wěn)地推動(dòng)推片至載玻片的另一端。3.干燥將推好的血涂片在空中晃動(dòng)，使其迅速干燥

血涂片的制備

將推片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。一張良好的血涂片要求厚薄適宜頭體尾明顯邊緣整齊，兩側(cè)留有空隙注意事項(xiàng)1.載玻片應(yīng)清潔、干燥、中性、無塵、無油脂，表面平而光滑。新購置的載玻片常帶有游離堿質(zhì)，必須用約1mol/LHCL浸泡24小時(shí)后，再用清水沖洗，干燥后備用。2.推片與血液接觸的邊緣要光滑、整齊，推片使用后要及時(shí)把血擦干凈。3.推好的血涂片應(yīng)在空氣中晃動(dòng)，使其盡快干燥。天氣寒冷或潮濕時(shí)，應(yīng)與37℃恒溫箱中保溫促干，以免細(xì)胞變形縮小。4.血涂片應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)染色或在1小時(shí)內(nèi)用無水甲醇（含水量﹤3%)固定后染色。注意事項(xiàng)5.血涂片影響因素主要有：血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快則血膜厚，反之則血膜薄。所以針對不同的患者應(yīng)有的放矢，對紅細(xì)胞比積高、血黏度高的患者應(yīng)采用小血滴、小角度、慢推；而貧血患者則采用大血滴、大角度、快推。

血涂片染色

常用的染色方法瑞氏（Wright）染色法：

對胞漿染色效果好，特別是中性顆粒，對核著色較差。瑞氏-姬姆薩（Wright-Giemsa)復(fù)合染色法：

即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液?；蛳扔萌鹗先旧ㄈ旧?，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。

瑞氏染色法原理

瑞氏染色法使細(xì)胞著色既有化學(xué)親和反應(yīng)，又有物理吸附作用。各種細(xì)胞由于其所含化學(xué)成分不同，對染料的親和力也不一樣，因此，染色后各種細(xì)胞呈現(xiàn)出各自的染色特點(diǎn)。瑞氏染色法試劑1.瑞氏染液：（1）瑞氏染料0.1g

（2）甲醇60ml

（3）中性甘油2～3ml2.PH6.8磷酸鹽緩沖液瑞氏染液（1）瑞氏染料：由酸性染料伊紅和堿性染料美蘭的氧化物（天青）組成。（2）甲醇：作為一種有機(jī)溶劑可使瑞氏染料保持在解離狀態(tài)（M+E-）；同時(shí)甲醇具有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)并使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀，形成顆粒狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸的表面積，提高對染料的吸附作用，增加染色效果。（3）甘油：防止染色中染料過早揮發(fā)，并可使細(xì)胞著色清晰。染色方法1.用蠟筆在血膜兩頭畫線，然后將血片平放在染色架上2.加瑞氏染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)血膜，固定細(xì)胞約1分鐘3.滴加等量或加倍的緩沖液，用洗耳球吹，使之與染液充分混勻，并染色5－10分鐘4.清水在玻片無血膜處沖去染液，待干后鏡檢染色結(jié)果

血膜外觀成紫紅色,

紅細(xì)胞呈粉紅色，細(xì)胞核呈紫紅色，嗜酸性顆粒呈桔紅色，嗜堿性顆粒呈紫黑色。注意事項(xiàng)1.pH值對細(xì)胞染色有影響由于細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)均為兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定。對某一蛋白質(zhì)而言，如環(huán)境pH﹤pI(蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)），則該蛋白質(zhì)帶正電荷，即在酸性環(huán)境中正電荷增多，易于酸性伊紅結(jié)合，染色偏紅；相反，則易于美蘭天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。為此，應(yīng)使用清潔中性的載玻片，稀釋染液必須用pH6.8緩沖液。沖洗玻片必須用流水。偏酸合適偏堿注意事項(xiàng)2.未干透的血膜不能染色，否則染色時(shí)血膜會(huì)脫落。3.染色時(shí)間與染液濃度、染色時(shí)溫度成反比；而與細(xì)胞數(shù)量成正比。4.沖洗時(shí)不能先倒掉染料，應(yīng)用流水沖去，以防染料沉淀在血膜上。5.如血膜上有染料顆粒沉積，可加少許甲醇溶解，但需立即用水沖掉甲醇，以免脫色。注意事項(xiàng)6.染色過淡，可以復(fù)染。復(fù)染時(shí)應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好的染色環(huán)境，而后加染液，或加緩沖液與染液的混合液，不可先加染液。7.染色過深，可用水沖洗或浸泡水中一定時(shí)間，也可用甲醇脫色。8.染色偏堿或染色偏酸，均應(yīng)更換緩沖液再重染。瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色法

姬姆薩染色原理與瑞氏染色相同，但提高了噻嗪染料的質(zhì)量，加強(qiáng)了天青的作用，對細(xì)胞核著色效果較好，但對中性顆粒著色較瑞氏染色差。因此，瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色法可取長補(bǔ)短，使血細(xì)胞的顆粒及胞核均能獲得滿意的染色效果。染色方法

珠海貝索生物技術(shù)有限公司試劑盒方法：

1.滴加瑞氏-姬姆薩A液（約0.5ml～0.8ml）于涂片上，并讓染液覆蓋整個(gè)標(biāo)本涂片染色1分鐘。

2.再將瑞氏-姬姆薩B液滴加于A液上面（滴加之量為A液的

2～3倍），以嘴或洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀，使兩液充分混勻，染色（3～10）分鐘。

3.水洗（沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖去，以防有沉渣沉淀在標(biāo)本上），干燥、鏡檢。

白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆诊@微鏡白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的方法及各種白細(xì)胞的正常形態(tài)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)原理

將血液制成血涂片，用瑞氏-姬姆薩染液染色，根據(jù)各類細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和顏色差異將白細(xì)胞區(qū)別并進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常分類100個(gè)白細(xì)胞，計(jì)算得出各種白細(xì)胞所占的百分率。白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)用品：

顯微鏡、香柏油、擦鏡紙等已制備好的血涂片分類計(jì)數(shù)方法1.低倍鏡觀察白細(xì)胞的數(shù)量、分布和染色情況觀察全片，包括白細(xì)胞的分布和染色情況2.選擇血涂片體尾交界處染色良好的部位，用油鏡分類100－200個(gè)細(xì)胞3.記錄五種白細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)血涂片的觀察

鏡檢部位：一般體積小的細(xì)胞分布在頭部和體部比較多；而尾部和兩側(cè)以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞較多，異常大的細(xì)胞在片尾末端出現(xiàn)，所以在體尾交界處觀察細(xì)胞。血涂片的觀察

經(jīng)染色后的血涂片先用低倍鏡觀察：1.染色情況(滿意、偏酸、偏堿）2.觀察細(xì)胞分布情況，選擇細(xì)胞分布均勻之處轉(zhuǎn)浸油鏡進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。油鏡分類時(shí)應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計(jì)數(shù)。李四123血涂片的觀察記錄方法（1）手工完全記錄法：將所見的白細(xì)胞按其分類用“正”或“++++”的方法記錄至所需總數(shù)（2）手工半記錄法：用上法記錄除中性粒細(xì)胞以外的各種白細(xì)胞，同時(shí)默記總數(shù)至所需細(xì)胞數(shù)（3）分類記數(shù)器法參考值白細(xì)胞百分率（%）絕對值（x109/L）中性桿狀核粒細(xì)胞1-50.04-0.5中性分葉核粒細(xì)胞50-702-7嗜酸性粒細(xì)胞0.5-50.02-0.5嗜堿性粒細(xì)胞0-10-0.1淋巴細(xì)胞20-400.8-4單核細(xì)胞3-80.12-0.8外周血中白細(xì)胞形態(tài)白細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞

中性分葉核粒細(xì)胞中性桿狀核粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性桿狀核粒細(xì)胞胞體圓形，直徑10-15um，為紅細(xì)胞的兩倍胞質(zhì)豐富，粉紅色，含較多細(xì)小均勻的紫紅色中性顆粒細(xì)胞核染色質(zhì)粗糙不勻，排列緊密，為深紫紅色

中性分葉核粒細(xì)胞胞體圓形，直徑10-15um，為紅細(xì)胞的兩倍胞質(zhì)豐富，粉紅色，含較多細(xì)小均勻的紫紅色中性顆粒細(xì)胞核染色質(zhì)粗糙不勻，排列緊密，為深紫紅色標(biāo)準(zhǔn)：核徑最窄處小于最寬處1/3為分葉核核徑最窄處大于最寬處1/3為桿狀核嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞圓形，直徑14-16um胞漿內(nèi)充滿粗大、整齊、均勻、排列緊密、有立體感的桔紅色嗜酸性顆粒，偶見少許淡藍(lán)或無色胞漿嗜酸性粒細(xì)胞容易破碎，顆?？煞稚⒂诩?xì)胞周圍

嗜堿性粒細(xì)胞

細(xì)胞圓形，直徑14-16um胞漿少，常呈淡紅或淡紫紅色，含少量粗大、不均勻、排列不規(guī)則的紫黑色嗜堿性顆粒，常蓋于核上，及細(xì)胞邊緣淋巴細(xì)胞小淋巴細(xì)胞：細(xì)胞圓形，直徑6-10um，胞漿很少，有的僅在核的一側(cè)出現(xiàn)一線藍(lán)色胞漿，甚至完全沒有。細(xì)胞核圓形，偶見凹陷，染色質(zhì)粗糙致密，可有塊狀。大淋巴細(xì)胞：體積較大，直徑10-15um，胞漿豐富，呈透明藍(lán)色，常有少量粗大、大小不均的紫紅色嗜天青顆粒。細(xì)胞核染色質(zhì)疏松單核細(xì)胞細(xì)胞圓形或不規(guī)則形，為外周血中最大的細(xì)胞，直徑15-25um胞漿豐富，染淡藍(lán)或灰藍(lán)色，呈毛玻璃樣半透明，含有大量細(xì)小、灰塵樣嗜天青顆粒，可見空泡細(xì)胞核大，呈不規(guī)則圓形、腎形、馬蹄形或不規(guī)則分葉，有時(shí)折疊扭曲染色質(zhì)細(xì)致、疏松如網(wǎng)狀

白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

概念

外周血中五種類型白細(xì)胞的

相對百分比和絕對計(jì)數(shù)一般情況計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，并計(jì)算出各種白細(xì)胞所占的比例。同時(shí)觀察各種細(xì)胞的形態(tài)（大小、外形、胞質(zhì)、胞核）有無變化。血常規(guī)檢驗(yàn)流程樣品采集靜脈采血 毛細(xì)血管采血自動(dòng)化血細(xì)胞分析儀WBC手工分類計(jì)數(shù)樣品采集紫色真空采血管抗凝劑：EDTA-K21.5-2.0mg/mlHemocytometer試驗(yàn)原理Wright-Giemsa:甲醇:將細(xì)胞固定在玻片上美蘭染液與RNA,DNA結(jié)合===藍(lán)色/紫色伊紅與血紅蛋白，嗜酸性顆粒結(jié)合===粉色/紅色磷酸鹽緩沖液的pH值非常重要血涂片制作：推片載玻片血液將推片勻速向前，勿停頓。涂片的厚薄取決于速度和角度：快、大(厚)。慢、?。ū。┮粡垵M意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號李四B123試驗(yàn)步驟血涂片的制備：推片角度30-40度血涂片的厚薄的影響因素：推片角度推片速度血樣的粘滯度lowHCTsmallangle

尾體頭血涂片染色Wright’sGiemsa染色:1-2min磷酸鹽緩沖液:15min蒸餾水沖洗干凈染色時(shí)間受染液濃度和室內(nèi)溫度影響血涂片染色勿沖洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后將Ⅰ液和Ⅱ液充分混允靜置10分鐘直接流水沖洗3-5分鐘（切勿先到掉染液）涂片經(jīng)水洗干燥后用油鏡分類計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞李四123涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴覆蓋整個(gè)血膜1分鐘顯微鏡鏡檢10倍鏡:觀察血涂片的質(zhì)量、血細(xì)胞是否凝集、是否有寄生蟲。100倍油鏡：觀察紅細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。血涂片的觀察：

經(jīng)染色后的血涂片先用低倍鏡觀察：1.染色情況(滿意、偏酸、偏堿）2.觀察細(xì)胞分布情況，選擇細(xì)胞分布均勻之處轉(zhuǎn)浸油鏡進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。油鏡分類時(shí)應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計(jì)數(shù)。李四123外周血中白細(xì)胞形態(tài)白細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞

中性桿狀核粒細(xì)胞胞體圓形，直徑10-15um，為紅細(xì)胞的兩倍胞質(zhì)豐富，粉紅色，含較多細(xì)小均勻的紫紅色中性顆粒細(xì)胞核染色質(zhì)粗糙不勻，排列緊密，為深紫紅色Segmentedneutrophil胞體圓形，直徑10-15um，為紅細(xì)胞的兩倍胞質(zhì)豐富，粉紅色，含較多細(xì)小均勻的紫紅色中性顆粒細(xì)胞核染色質(zhì)粗糙不勻，排列緊密，為深紫紅色標(biāo)準(zhǔn)：核徑最窄處小于最寬處1/3為分葉核核徑最窄處大于最寬處1/3為桿狀核Eosinophil細(xì)胞圓形，直徑14-16um胞漿內(nèi)充滿粗大、整齊、均勻、排列緊密、有立體感的桔紅色嗜酸性顆粒，偶見少許淡藍(lán)或無色胞漿嗜酸性粒細(xì)胞容易破碎，顆?？煞稚⒂诩?xì)胞周圍Basophil細(xì)胞圓形，直徑14-16um胞漿少，常呈淡紅或淡紫紅色，含少量粗大、不均勻、排列不規(guī)則的紫黑色嗜堿性顆粒，常蓋于核上，及細(xì)胞邊緣Lymphocyte小淋巴細(xì)胞：細(xì)胞圓形，直徑6-10um，胞漿很少，有的僅在核的一側(cè)出現(xiàn)一線藍(lán)色胞漿，甚至完全沒有。細(xì)胞核圓形，偶見凹陷，染色質(zhì)粗糙致密，可有塊狀。大淋巴細(xì)胞：體積較大，直徑10-15um，胞漿豐富，呈透明藍(lán)色，常有少量粗大、大小不均的紫紅色嗜天青顆粒。細(xì)胞核染色質(zhì)疏松Monocyte細(xì)胞圓形或不規(guī)則形，為外周血中最大的細(xì)胞，直徑15-25um胞漿豐富，染淡藍(lán)或灰藍(lán)色，呈毛玻璃樣半透明，含有大量細(xì)小、灰塵樣嗜天青顆粒，可見空泡細(xì)胞核大，呈不規(guī)則圓形、腎形、馬蹄形或不規(guī)則分葉，有時(shí)折疊扭曲染色質(zhì)細(xì)致、疏松如網(wǎng)狀中性分葉核嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞中性桿狀核淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞參考值正常參考值

中性粒細(xì)胞50-70%嗜酸性粒細(xì)胞0.5-5%嗜堿性粒細(xì)胞0-1%單核細(xì)胞3-8%淋巴細(xì)胞20-40%