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文檔簡介
腦心同治理論與丹紅注射液對腦缺血性損傷保護機制研究
浙江中醫(yī)藥大學萬海同教授當前第1頁\共有71頁\編于星期四\22點
萬海同二級教授首席教授博導所長院長
國家百千萬人才工程專家享受國務院政府津貼人員國家中醫(yī)藥管理局“十二五”重點學科(中醫(yī)工程學)帶頭人國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)臨床基礎重點學科帶頭人浙江省高校腦血管病創(chuàng)新團隊負責人浙江省中西醫(yī)結(jié)合學會腦心同治專業(yè)委員會主任委員浙江省中西醫(yī)結(jié)合腦病重點學科負責人浙江中醫(yī)藥大學心腦血管疾病研究所所長浙江中醫(yī)藥大學生物工程學院院長浙江省中醫(yī)藥重點學科(中藥藥物代謝動力學)帶頭人中華中醫(yī)藥學會中藥制劑分會副主任
當前第2頁\共有71頁\編于星期四\22點主要內(nèi)容三丹紅注射液對腦缺血性損傷保護機制研究二腦心同治理論一心腦血管疾病的防治現(xiàn)狀當前第3頁\共有71頁\編于星期四\22點
第一部分心腦血管疾病的防治現(xiàn)狀當前第4頁\共有71頁\編于星期四\22點一、心腦血管病是一復雜、難治性疾病,對人類危害嚴重防治腦病已成為社會和醫(yī)學界廣泛關注的重要課題死亡率居高不下世界范圍:死于心腦血管病1500萬人/年;
占全球死亡人數(shù)的三分之一至二分之一;
是危害人類最大疾病。
中國:死于心腦血管病每天有7000人,每12秒鐘就有1人;首次發(fā)年齡,30%以上在60歲之前。
當前第5頁\共有71頁\編于星期四\22點我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人!
我國每年死于心腦血管疾病300萬人!幸存下來的患者:75%不同程度喪失勞動能力;50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理;40%重殘。我國腦中風病人出院后第一年的復發(fā)率是30%,第五年的復發(fā)率高達59%;而二級預防做得較好的美國僅為10%。當前第6頁\共有71頁\編于星期四\22點各種危險因素居高不下中國目前總共有:1.6億高血壓患者;6000萬糖尿病患者;1.6億人群血脂異常;2億人體重超標;6000萬人肥胖;還有大量煙民、酒客更令人憂慮:城鄉(xiāng)差別不大;中年人與老年人患病率接近;中風與心肌梗塞、心力衰竭常伴隨發(fā)生。當前第7頁\共有71頁\編于星期四\22點
二、抗血栓治療成為西醫(yī)學治療動脈粥樣硬化、冠心病、腦梗死治療的重要基石隨著心腦缺血性血管疾病發(fā)生率增加,越來越多患者需要長期應用抗血栓藥物,臨床常用抗凝藥物為華法林,抗血栓藥物多為氯吡格雷及阿司匹林等。尤其是抗血小板聚集藥已成為心腦血管疾病常規(guī)治療。當前第8頁\共有71頁\編于星期四\22點三、西醫(yī)學對腦梗死內(nèi)科治療仍是抗栓、溶栓等,有一定療效,但也有并發(fā)癥等溶栓
降纖
血栓、栓子血管堵塞缺血損傷抗血栓迅速復流腦保護減慢缺血級聯(lián)反應
限制再損傷
易致出血性梗死并發(fā)癥
再閉塞不足之處不能改善半暗區(qū)血供當前第9頁\共有71頁\編于星期四\22點
抗血小板藥物作用機制圖偱證醫(yī)學新證據(jù)表明:
抗血栓西藥療效欠佳,并認為抗血小板西藥是一把雙刃劍:在降低心腦血管不良事件的同時,許多抗血小板聚集西藥也帶來了出血并發(fā)癥??寡ㄋ幬镏饕郑嚎寡“寰奂?、抗凝血藥、溶血栓藥
當前第10頁\共有71頁\編于星期四\22點主要副作用:口服抗血栓藥物引起顱內(nèi)出血的發(fā)生率在9-13%,死亡率超過50%抗凝溶栓對已形成血栓無直接溶栓作用,且溶栓易致出血性梗死(腦出血6.4%-19.8%,腦死亡率50%)和再閉塞等危險阿司匹林藥物抵抗率達5.5%-61%當前第11頁\共有71頁\編于星期四\22點藥物種類藥物作用機制試驗狀況谷氨酸鈉拮抗劑CGS19755競爭性NMDA拮抗劑三期無效YM-872AMPA受體拮抗劑三期無效ApiganelNMDA通道阻滯劑三期無效鎂NMDA受體拮抗劑三期無效GV150526NMDA拮抗劑三期無效電壓門鈣通道拮抗劑尼莫地平減少鈣離子內(nèi)流三期無效鉀通道激動劑BMS-204352減少鈣離子內(nèi)流三期無效鈉通道拮抗劑磷酸苯妥英降低興奮性氨基酸釋放三期無效5羥色胺能受體激動劑Repinotan三期無效伽馬氨基丁酸激動劑氯美噻唑降低興奮性氨基酸釋放三期無效自由基清除劑替拉扎特降低自由基團的損傷三期無效依布硒啉三期無效依達拉奉三期有效NXY-059三期無效星形膠質(zhì)細胞抑制劑ONO-2506三期無效一氧化氮供體硝酸甘油二期無效一氧化氮阻滯劑蘆貝魯唑減少NO介導損傷三期無效目前臨床上還缺少療效滿意的西藥,通常采用中西醫(yī)結(jié)合的方法當前第12頁\共有71頁\編于星期四\22點三、步長腦心通膠囊、丹紅注射液等活血化瘀、或益氣活血中藥已廣泛用于心腦血管疾病,如缺血性心臟病、缺血性中風等)及血栓性疾病等,具有較好療效。當前第13頁\共有71頁\編于星期四\22點
第二部分腦心同治理論當前第14頁\共有71頁\編于星期四\22點一、腦心同治理論繼承和發(fā)展了中醫(yī)的整體觀、辨證施治理論“天人合一”的整體觀“因時因地因人”辨證施治激發(fā)人體自身抗御疾病的特點
中醫(yī)藥優(yōu)勢當前第15頁\共有71頁\編于星期四\22點二、腦心同治理論的依據(jù)中風(腦卒中)胸痹(冠心?。馓撗鲎C證屬益氣活血化瘀通絡治則證同治則同異病同治趙步長教授認為腦心同治理論對中風、胸痹的認識腦心同治理論的機制研究氣虛、血瘀、痰濁、絡阻病機益氣、活血、化痰、通絡治則探討氣、血、痰(及瘀)、絡的相互關系現(xiàn)代醫(yī)學實驗證據(jù)《腦心同治》理論核心:
從整體觀角度來詮釋心腦血管?。ㄖ酗L、胸痹)的證屬與病機、治則(一)中醫(yī)角度
當前第16頁\共有71頁\編于星期四\22點(二)中醫(yī)腦心同治理論與現(xiàn)代醫(yī)學認識的相關性
中風(腦卒中)胸痹(冠心?。馓撗鲎C證屬益氣活血化瘀通絡治則證同治則同異病同治趙步長教授認為宏觀準確性微觀精確性腦心同治理論對中風胸痹認識:現(xiàn)代醫(yī)學對心、腦血管病認識:內(nèi)皮損傷血小板凝集、活化、血栓形成血漿成分通透性增強單核細胞、淋巴細胞被激活VEGF,淋巴循環(huán)泡沫細胞平滑肌細胞移行、增生脂蛋白變性纖維肌性內(nèi)膜增厚膠原蛋白彈性應蛋白防御結(jié)構(gòu)的障礙(HDL)異常粥樣硬化灶動脈狹窄、阻塞或痙攣臨床發(fā)作冠心病、腦梗塞等PDGF高脂血癥、高血壓、吸煙等當前第17頁\共有71頁\編于星期四\22點動脈粥樣瘢塊形成及其后果瘢塊開始形成穩(wěn)定瘢塊不穩(wěn)定瘢塊瘢塊破裂當前第18頁\共有71頁\編于星期四\22點當前第19頁\共有71頁\編于星期四\22點危險因素:高血壓、血脂異常糖尿病、吸煙、肥胖(中心型)動脈粥樣硬化左室肥厚冠脈病變心肌缺血冠脈栓塞心肌、腦梗死心腦血管病事件鏈(continuum)神經(jīng)體液激活心律失常心肌損失心性猝死心臟重構(gòu)心室擴大心衰心臟病終末期當前第20頁\共有71頁\編于星期四\22點無癥狀自然消退或增大復原功能不良短期死亡(≤28天)晚期復發(fā)(﹥28天)晚期死亡(﹥28天)疾病狀態(tài)血管內(nèi)粥樣瘢塊不斷發(fā)展瘢塊或血栓的表面破裂癥狀性缺血
猝死動脈硬化性心腦血管病自然進程
基礎病變促發(fā)因素急性事件中期和晚期發(fā)展(幾年至幾十年)(幾秒鐘或幾小時)(幾秒鐘或幾小時)(幾天至幾年)時間順序當前第21頁\共有71頁\編于星期四\22點三、中醫(yī)藥防治心腦血管病常用藥益氣藥:黃芪、太子參等活血化瘀藥:水蛭、蜈蚣、地龍、全蝎當歸、川芎、丹參、紅花、
赤芍、桃仁、雞血藤、牛膝等理氣、通陽藥:乳香、沒藥、桂枝當前第22頁\共有71頁\編于星期四\22點配伍用藥是中藥復方(或方劑)發(fā)揮藥效的關鍵,是中醫(yī)處方用藥的核心方劑配伍基本內(nèi)容:“七情合和”與“君臣佐使”理論“君臣佐使”則表明中藥配伍中藥組分有主有次。主藥在治病中發(fā)揮主導作用,輔藥在治療中促使主藥藥力得以充分發(fā)揮,同時抑制主藥的毒副作用。
中醫(yī)重視復方用藥及其中藥配伍理論當前第23頁\共有71頁\編于星期四\22點
丹紅注射液、腦心通膠囊等中藥制劑相對于西藥抗血小板作用機制單一,具有多組分、多靶點作用特點。意味著本品可能有更少耐藥性和更少副作用。中藥具有多組分、多靶點的作用特征當前第24頁\共有71頁\編于星期四\22點四、中藥目前面臨的困惑“?”中藥在醫(yī)學科學領域的作用逐漸被國內(nèi)外同行認可和關注。困惑:中藥如何發(fā)揮作用?這些作用如何科學表達?中醫(yī)藥如何合理使用?如何達到中藥清楚定位并做到“精準用藥”?目前這些問題尚不十分清楚國內(nèi)外同行基本一致認同是:中藥作用物質(zhì)基礎說不清中藥作用機理說不清中藥(組分)相互作用說不清質(zhì)量控制、安全問題說不清當前第25頁\共有71頁\編于星期四\22點中醫(yī)藥應該在臨床有效的基礎上,更須多關注這些尚未能解決的中醫(yī)藥臨床應用的疑難問題,以便更好地為中醫(yī)臨床應用服務。換言之:中醫(yī)藥在這些方面的問題得到解決,將會有力推動中醫(yī)藥學科的快速發(fā)展,也會得到國際國內(nèi)同行和社會對中醫(yī)藥更為廣泛認同的效果。當前第26頁\共有71頁\編于星期四\22點開展了丹紅注射液、腦心通膠囊發(fā)揮治療冠心病、缺血性中風等血瘀病證的系統(tǒng)研究如:丹紅注射液如何發(fā)揮組分相互作用,組分體內(nèi)過程如何,哪些是具有生物活性的代謝產(chǎn)物,最終通過哪些環(huán)節(jié)、途徑發(fā)揮活血化瘀效應最終實現(xiàn)整合調(diào)節(jié)治療冠心病、缺血性中風等問題。當前第27頁\共有71頁\編于星期四\22點第三部分丹紅注射液對腦缺血性損傷保護機制研究1丹紅注射液的主要適用病證
2丹紅注射液中化學成分及代謝產(chǎn)物研究4丹紅注射液對腦缺血性損傷的保護作用5
丹紅注射液抗腦缺血性損傷的機制研究6科研項目、論文、專利情況3丹紅配伍的理論依據(jù)當前第28頁\共有71頁\編于星期四\22點一、丹紅注射液的主要主要適用病證
丹紅注射液(國藥準字Z20026866),是臨床上常用的、有效的中藥制劑。是銷售額最高的中藥制劑之一,近年,年銷售超過10億元。具有活血化瘀、通脈舒絡功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風,證見:胸痛,胸悶,心悸,口眼歪斜,言語蹇澀,肢體麻木,活動不利等癥。治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞,缺血性腦病、腦血栓及肺心病所瘀諸癥。當前第29頁\共有71頁\編于星期四\22點運動是一箭多雕的成本效價比最高的預防心血管病的措施高血壓高血脂糖尿病肥胖丹紅注射液一箭多雕預防心腦血管病機理?腦梗死冠心病當前第30頁\共有71頁\編于星期四\22點丹紅注射液(國藥準字Z20026866),為臨床上常用的、有效的中藥制劑。是銷售額最高的中藥制劑之一。丹紅注射液處方用量配比:丹參750g,紅花250g。二、丹紅配伍的理論依據(jù)當前第31頁\共有71頁\編于星期四\22點
丹參:味苦,性微寒,歸心、肝經(jīng),功效活血化瘀、涼血消腫、寧心安神。紅花:味辛,性溫,歸心、肝經(jīng),辛散溫通,入血分,能活血祛瘀化滯、通調(diào)經(jīng)脈。二藥共奏活血化瘀、通經(jīng)活絡之功當前第32頁\共有71頁\編于星期四\22點(一)HPLC-DAD測定丹紅注射液中的有效成分6種有效成分紫外檢測波長的選擇
250300350400450500550600650A波長/nm6種對照品混合溶液的濃度250300350400450500550600650B波長/nm250300350400450500550600650C波長/nm吸光度(A)250300350400450500550600650D波長/nm250300350400450500550600650E波長/nm吸光度(A)250300350400450500550600650F波長/nmA.丹參素鈉;B.原兒茶醛;C.咖啡酸;D.迷迭香酸;E.丹酚酸B;F.丹酚酸A
名稱丹參素鈉原兒茶醛咖啡酸迷迭香酸丹酚酸丹酚酸濃度(mg·mL-1)1.3100.1010.00410.1090.2193.360結(jié)果表明:丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A檢測波長為280nm;咖啡酸、迷迭香酸檢測波長為330nm。三、丹紅注射液中化學成分及代謝產(chǎn)物研究當前第33頁\共有71頁\編于星期四\22點混合對照品溶液HPLC色譜圖
05101520253035401256t/minA051015202530354034Bt/min0510152025303540156t/minC051015202530354003t/minD
1.丹參素;2.原兒茶醛;3.咖啡酸;4.迷迭香酸;5.丹酚酸B;6.丹酚酸AA.對照品溶液(280nm);B.對照品溶液(330nm);C.供試品溶液(NO.110934280nm);D.供試品溶液(NO.110934330nm)
色譜條件:色譜柱:EclipseXDB-C18
(4.6×150mm,5μm)
;流動相:A為乙腈,B為0.1%磷酸水溶液;柱溫為30℃;流速為1.0mL?min-1.時間0~6min6~16min16~30min30~40min濃度5%A~5%A5%A~15%A15%A~26%A26%A~27%A
流動相梯度洗脫程序結(jié)果表明:該色譜條件下,樣品液中6種成分與其他共存峰得到很好的分離。當前第34頁\共有71頁\編于星期四\22點10批丹紅注射液中6種成分及總黃酮含量(n=3)批號丹參素μg?mL-1原兒茶醛μg?mL-1咖啡酸μg?mL-1迷迭香酸μg?mL-1丹酚酸Bμg?mL-1丹酚酸Aμg?mL-1總黃酮μg?mL-1111050110934110928110937111042111033110858110926110927110950平均1464.981238.031391.211363.291378.931308.491346.361570.801390.561309.611376.23300.54369.17445.82345.23235.84268.05260.56412.30364.07367.06336.865.404.687.985.394.975.525.055.436.135.495.60262.17215.75236.16286.24237.06246.85163.51300.25233.68259.71244.13573.65270.41297.53396.47517.43441.90305.84399.65310.21402.57391.574650.414220.464067.065634.775083.914458.793845.145083.644711.884851.214660.72101971047092771162896869839958311799104181166310456丹紅注射液樣品中有效成分含量的HPLC-DAD測定丹紅注射液中6種成分的含量結(jié)果表明:色譜條件下,樣品液6種成分中丹酚酸A含量最高,咖啡酸含量最低,含量高低依次是丹酚酸A、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸、咖啡酸。當前第35頁\共有71頁\編于星期四\22點(二)對7批丹紅注射液進行指紋圖譜檢測
1.標定了28個共有峰,7批丹紅注射液指紋圖譜相似度均大于0.980,表明工藝較穩(wěn)定、質(zhì)量可控。
7批丹紅注射液指紋圖譜與對照指紋圖譜當前第36頁\共有71頁\編于星期四\22點2.7批血漿、腦、肝臟組織樣品特征圖譜相似度均在0.92以上,說明特征指紋圖譜相對穩(wěn)定、準確,可用于體內(nèi)成分定性分析
7批丹紅注射液15min血液中指紋圖譜對照指紋圖譜
7批丹紅注射液60min腦中指紋圖譜對照指紋圖譜7批丹紅注射液60min肝中指紋圖譜對照指紋圖譜當前第37頁\共有71頁\編于星期四\22點3.LC-MS(QTrap4500)質(zhì)譜分析丹紅注射液成分及其體內(nèi)代謝物當前第38頁\共有71頁\編于星期四\22點4.EMS-IDA-EPI掃描模式:所有色譜峰可掃描到EPI譜圖,EMS展示107個掃描到最高峰化合物丹紅注射液主要有效成分列表當前第39頁\共有71頁\編于星期四\22點丹參素提取離子流圖(XIC,m/z197)及MS2
通過丹參素特征碎片離子m/z179掃描可以找到結(jié)構(gòu)類似物當前第40頁\共有71頁\編于星期四\22點原兒茶醛提取離子流圖(XIC,m/z137)及MS2
羥基紅花黃色素A提取離子流圖(XIC,m/z611→491)及MS2
當前第41頁\共有71頁\編于星期四\22點丹酚酸B提取離子流圖(XIC,m/z717)及MS2
MS3掃描:丹酚酸A:RT10.4min,判斷二級碎片來源,比如二級碎片m/z159及m/z185來源小結(jié):丹紅注射液中有效成分主要是水溶性的酚酸類組分,極性較大。當前第42頁\共有71頁\編于星期四\22點5.丹紅注射液代謝產(chǎn)物分析丹紅注射液中水溶性酚酸類有效成分較多,極性較大;體內(nèi)I相代謝反應,通過氧化、
還原、水解等途徑引入極性,使原藥極性增大,利于排泄。主要以丹參素,迷迭香酸,原兒茶醛,原兒茶酸為目標組分,尋找相應代謝物.,丹紅注射液代謝產(chǎn)物列表丹參素(Danshensu,DSS)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜當前第43頁\共有71頁\編于星期四\22點原兒茶酸(Protocatechuicacid,DBA)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜原兒茶醛(Protocaterchuicaldehyde,PA)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜當前第44頁\共有71頁\編于星期四\22點迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜特征II相代謝物含量隨給藥時間變化的趨勢(Area:MRM)小結(jié):EMS-IDA-EPI,MRM-IDA-EPI,Pre/NL-IDA-EPI等多種掃描模式結(jié)合,發(fā)現(xiàn)注射液中含量較高的有效成分丹參素,原兒茶酸,原兒茶醛,迷迭香酸的II相代謝物,主要是甲基化,硫酸化,甲基化后硫酸化,葡萄糖醛酸化等一系列代謝物。各時間點代謝樣品中丹參素與迷迭香酸原形在代謝樣品未檢測到,僅檢測到代謝物。初步鑒定丹紅注射液中有效成分32個,同時鑒定了主要有效成分的代謝產(chǎn)物。當前第45頁\共有71頁\編于星期四\22點CombinationsParametersCom1Com2Com3Com4Com5Com6Com7Com8Com9Emax(U/ml)0.7310.6430.4750.4780.7550.70.6920.7420.701EC50(μg/ml)0.1551.4230.310.120.280.4526.羥基紅花黃色素A與MDA相關的藥效動力學參數(shù)9個組方時間-羥A藥物濃度-MDA三維動態(tài)模型當前第46頁\共有71頁\編于星期四\22點(1)丹紅注射液對神經(jīng)功能缺損癥狀的影響
四、丹紅注射液對腦缺血性損傷的保護作用Day0Day3Day7Day10Day14
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
MCAO
大腦中動脈栓塞模型(MCAO)示意圖
在MCAO模型再灌之后的1d、3d、7d、10d和14d進行神經(jīng)功能評分:1.自主活動(0-3)2.四肢運動的對稱性(0-3)3.前肢外伸(0-3)4.爬動(1-3)5.身體觸覺(1-3)6.震動覺(1-3)
其中3分最差,18分正常
Garciaetal.Stroke,1995.26(4):627-634
Day1Day3Day7Day10Day14
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
Neurologicalassessment
當前第47頁\共有71頁\編于星期四\22點注:*P<0.01vsSham,ΔP<0.05vsIRU,#P<0.01vsDHI-1各組在大鼠腦缺血后不同時間點的神經(jīng)功能缺損評分變化曲線11當前第48頁\共有71頁\編于星期四\22點(2)丹紅注射液對大鼠腦缺血后腦梗死體積的影響A假手術(shù)組B模型組C丹紅注射液0.5ml/kgD丹紅注射液1.0ml/kgE丹紅注射液2.0ml/kgMCAO法制作大腦中動脈局灶性栓死模型
丹紅注射液對大鼠腦缺血后腦梗死體積的影響組別劑量(ml/kg)n總梗死體積(mm3)假手術(shù)組NS1000模型組NS10213.572.4*丹紅低劑量組0.510152.753.8#丹紅中劑量組1.010116.547.6##▲丹紅高劑量組2.010103.254.2##▲注:*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較,F(xiàn)檢驗;#P<0.05,##P<0.01,與模型組比較,F(xiàn)檢驗?!鳳<0.05,與低劑量組比較,F(xiàn)檢驗。
丹紅注射液對大鼠腦缺血后腦梗死的影響結(jié)果可見:丹紅注射液可使梗死總體積減少,與模型組相比具有顯著性差異。當前第49頁\共有71頁\編于星期四\22點五、丹紅注射液抗腦缺血性損傷的機制研究自由基過度形成炎癥反應纖溶系統(tǒng)受損興奮性氨基酸毒性細胞凋亡神經(jīng)系統(tǒng)損傷當前第50頁\共有71頁\編于星期四\22點(1)丹紅注射液對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)SOD活力和MDA含量影響
丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力和MDA含量的影響(X±SD)組別劑量(ml/kg)nSOD(NU/mg)MDA(nmol/mg.)假手術(shù)組NS10541.8±48.5411.6±36.5模型組NS10272.4±35.1*947.2±86.4*丹紅低劑量組0.510312.2±42.21858.3±93.9丹紅中劑量組1.010364.5±45.89#782.3±95.4丹紅高劑量組2.010397.1±50.61#689.3±95.4#▲注:*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較,F(xiàn)檢驗;#P<0.05,##P<0.01,與模型組比較,F(xiàn)檢驗;▲P<0.05,與低劑量組組比較,F(xiàn)檢驗。
丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力的影響丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)MDA含量的影響結(jié)果表明:(1)腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比,SOD活力、MDA含量均具有顯著差異。(2)丹紅注射液可顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力,高劑量組顯著降低腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)MDA含量。當前第51頁\共有71頁\編于星期四\22點(2)丹紅注射液對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGFlα含量的影響
丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦6-Keto-PGFlα含量的影響(X±SD)組別劑量(ml/kg)n6-Keto-PGFlα假手術(shù)組NS1086.31±8.31模型組NS1034.07±5.23*丹紅低劑量組0.51051.11±6.81#丹紅中劑量組1.01059.23±7.83##丹紅高劑量組2.010
65.36±7.52##▲注:*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較,F(xiàn)檢驗;#P<0.05,##P<0.01,與模型組比較,F(xiàn)檢驗;▲P<0.05,與低劑量組組比較,F(xiàn)檢驗。結(jié)果表明:(1)腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比具有顯著差異;(2)丹紅注射液各組能顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGF1α的含量;(3)丹紅注射液中、高劑量與低劑量相比具有顯著差異。
丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦6-Keto-PGFlα含量的影響當前第52頁\共有71頁\編于星期四\22點(3)丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠血漿t-PA活性和PAI活性的影響
丹紅注射液對腦缺血再灌注大鼠血漿t-PA活性和PAI活性的影響(X±SD)組別劑量(ml/kg)nt-PA(IU/ml)PAI(IU/ml)PAI/t-PA假手術(shù)組NS100.912±0.0730.652±0.0490.715模型組NS100.511±0.079*0.921±0.065*1.802丹紅低劑量組0.5100.632±0.072#0.891±0.0751.410丹紅中劑量組1.0100.689±0.082#0.842±0.0711.222丹紅高劑量組2.0100.697±0.083#0.762±0.068#1.093注:*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較,F(xiàn)檢驗;#P<0.05,與模型組比較,F(xiàn)檢驗。
t-PA:組織型纖溶酶原激活物;PAI:纖溶酶原激活物抑制因子結(jié)果表明:(1)腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比均具有顯著差異;(2)丹紅注射液各組與腦缺血再灌注組相比,可顯著提高t-PA活性,降低PAI活性,具有增強機體的纖溶功能、促進血栓溶解的作用。當前第53頁\共有71頁\編于星期四\22點(4)丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表達的作用
各組缺血側(cè)大腦皮層Bcl-2、Bax免疫組化陽性細胞數(shù)組別劑量(ml/kg)nBcl-2陽性細胞數(shù)Bax陽性細胞數(shù)Bcl-2/Bax假手術(shù)組NS1055.912.73模型組NS1084.415.6*86.815.2**0.97丹紅注射液1.010126.118.2#47.312.9#2.66注:*P<0.05,**P<0.01與假手術(shù)組比較;#P<0.05,##P<0.01,與模型組比較,F(xiàn)檢驗。
ABcl-2假手術(shù)組,BBcl-2模型組,CBcl-2丹紅注射液組,DBax組,EBax-假手術(shù)組,F(xiàn)Bax-丹紅注射液組
結(jié)果表明:(1)假手術(shù)與模型組相比,模型組缺血側(cè)大腦皮層Bcl-2免疫組化陽性反映細胞數(shù)顯著增多。(2)丹紅注射液組與腦缺血再灌注模型組相比Bcl-2陽性細胞數(shù)顯著增多。(3)丹紅注射液與模型組相比,可使Bax蛋白的表達降低。(4)丹紅注射液具有顯著調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白的表達,抑制神經(jīng)元凋亡,保護腦組織的作用。
當前第54頁\共有71頁\編于星期四\22點圖2微透析套管埋植123123混合對照品溶液和透析液的HPLC圖注:1.天門冬氨酸;2.谷氨酸;3.γ-氨基丁酸;A.人工腦脊液溶液
B.對照品溶液;C.空白大鼠頭部透析液圖1大腦中動脈阻塞模型(MCAO)0100200300400500600700800900-50050100150200模型組丹紅組丹紅注射液對腦缺血大鼠腦海馬區(qū)Asp釋放的影響050100150200250300350400-50050100150200模型組
丹紅注射液對腦缺血大鼠腦海馬區(qū)Glu釋放的影響min丹紅組02000400060008000100001200014000-50050100150200模型組丹紅組丹紅注射液對腦缺血大鼠腦海馬區(qū)GABA釋放的影響(5)丹紅注射液對腦部微透析液氨基酸遞質(zhì)釋放的影響丹紅注射液通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的含量,對腦缺血起到一定的保護作用。當前第55頁\共有71頁\編于星期四\22點丹紅注射液抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達,丹紅注射液對炎癥的抑制在腦缺血后恢復的過程中起著重要的作用。
開展的部分相關研究內(nèi)容(6)丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β炎癥因子的影響丹紅注射液對大鼠腦缺血后腦組織中TNF-α和IL-1β含量的影響當前第56頁\共有71頁\編于星期四\22點(7)丹紅注射液對大鼠大腦缺血后葡萄糖代謝的影響
分子影像技術(shù)能夠無創(chuàng)監(jiān)測生物體內(nèi)細胞和分子水平的生化過程,尤其是18F-FDG-PET(正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù))能夠定量地無創(chuàng)監(jiān)測葡萄糖代謝的變化,被廣泛應用于腦血管病療效的評價。當前第57頁\共有71頁\編于星期四\22點MACODay0Day3Day7Day10Day14
PETScanPETScanPETScan
利用18F-FDG-PET來研究丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用,丹紅注射液組的R/N變化值在給藥后7d、14d較模型組顯著增加,較好地促進了梗死區(qū)葡萄糖代謝的恢復。大鼠腦部FDG-PET橫斷切面的圖像
R/N變化值當前第58頁\共有71頁\編于星期四\22點
梗死區(qū)周邊的GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)免疫組化染色分析圖
(#P<0.01vsSham,**P<0.01vsIRU,ΔP<0.05vsDHI-1)ShamIRUDHI-2DHI-1DHI-4GFAP(200x)(8)丹紅注射液對大鼠腦缺血后星形膠質(zhì)細胞活化的影響
丹紅注射液促使腦缺血后星形膠質(zhì)細胞進一步活化,大量表達GFAP,從而促進腦缺血后神經(jīng)功能的恢復。當前第59頁\共有71頁\編于星期四\22點丹紅注射液能夠明顯抑制缺氧誘導的腦內(nèi)皮細胞早期凋亡進程和和G1/S期阻滯,且呈劑量依賴性。內(nèi)皮細胞100×兔抗鼠Ⅷ因子抗體鑒定******采用原代培養(yǎng)的乳鼠腦微血管內(nèi)皮細胞,建立缺氧損傷模型。(9)丹紅注射液對乳鼠腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用正常組模型組尼莫地平組100uL/mL組50uL/mL組25uL/mL組當前第60頁\共有71頁\編于星期四\22點
A正常組B模型組C丹紅注射液100uL/mL組丹紅注射液對缺氧細胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響(6K×)組別C/(uL.mL?1)SOD(U/mg)MDA(nmol/mL)正常組
-85.55±3.584.09±0.50模型組
-29.35±1.04▲▲10.18±1.35▲▲丹紅注射液組2533.97±4.208.80±1.00
5057.26±4.70**6.75±0.55**
10070.05±3.38**5.49±0.51**與正常組比較:▲▲P<0.01;與模型組比較:*P<0.05**P<0.01
丹紅注射液對缺氧損傷的rBMECsSOD活性和MDA水平的影響(x±s,n=6)A正常組B模型組C丹紅注射液100uL/mL組當前第61頁\共有71頁\編于星期四\22點
RT-PCR法檢測P53、MMP-9、ICAM-1mRNA的表達擴增曲線圖溶解曲線圖擴增曲線拐點清楚,整體平行性好,基線平而無上揚現(xiàn)象,曲線指數(shù)期斜率與擴增效率成正比,各反應管的擴增曲線平行性好,表明擴增效率良好且相近。溶解曲線直接表示了引物的特異性,TM值基本都在80-90度之間,三個引物都出現(xiàn)單一峰,說明特異性擴增良好。當前第62頁\共有71頁\編于星期四\22點
下調(diào)P53mRNA表達來抑制rBMEC早期凋亡和G1/S期阻滯;
下調(diào)ICAM-1mRNA表達介導黏附反應、促進內(nèi)皮細胞遷移、降低內(nèi)皮細胞活性;
下調(diào)MMP-9mRNA表達促進血管生成。以正常組為對照進行相對定量分析,丹紅注射液100、50uL/mL均能明顯降低MMP-9、ICAM-1、P53mRNA的表達水平。當前第63頁\共有71頁\編于星期四\22點
橋粒連接
絨毛電鏡觀察(Caco-221d200×)光鏡觀察藥物通過小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運途徑示意圖體外Caco-2細胞模擬體內(nèi)吸收,考察丹紅注射液的主要有效成分配伍在口服給藥后的吸收效果??诜o藥吸收
小腸生物利用度指導轉(zhuǎn)運樣品HPLC檢測(10)丹紅注射液主要有效成分配伍體外吸收特性當前第64頁\共有71頁\編于星期四\22點R2X(cum)=0.646R2Y(cum)=0.75,Q2=0.58(R2Y和Q2大于0.5時,說明模型較好)負離子模式下血清的PLS-DA得分圖(11)丹紅注射液調(diào)節(jié)血脂代謝的作用
以高脂血癥大鼠為模型,通過生化、分子生物學及代謝組學技術(shù)與方法,探討丹紅注射液在調(diào)節(jié)血脂代謝方面的作用機理,為其治療脂代謝相關疾病提供科學理論依據(jù)。當前第65頁\共有71頁\編于星期四\22點六、
科
研
項
目項目名稱來源基于中西藥相互作用的谷紅注射液多組分藥物代謝與藥效相關性研究國家自然科學基金(No.81373898)基于藥物相互作用的丹紅注射液對腦缺血性損傷保護機制研究國家自然科學基金項目(No.81173647)丹參、川芎(參芎注射液)活性物質(zhì)配伍方的多成分藥物代謝動力學與對腦缺血性損傷保護作用的相關性研究國家自然科學基金項目(No.81274176)丹參紅花多組分配伍方(丹紅注射液為示范)藥物體內(nèi)過程與抗血栓效應相關性研究國家自然科學基金項目(No.81473587)基于K+/Glu激活鈣信號通路的丹紅注射液腦靶向活性成分篩選及神經(jīng)保護機制研究浙江省自然科學基金項目(No.Y13H280035)中藥(丹紅配伍為例)多成分藥動學與藥效學相關聯(lián)的方法學研究浙江省科技廳項目(No.2013C33244)當前第66頁\共有71頁\編于星期四\22點已正式發(fā)表20余篇,待發(fā)表論文15篇HeY,WanH,DuY.etal.ProtectiveeffectofDanhonginjectiononcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.JournalofEthnopharmacology,2012,144(2):387-394.(SCI收錄,影響因子3.014)黃翔,何昱,楊潔紅,等.HPLC-DAD法與UV-VIS法對丹紅注射液有效成分和有效部位的質(zhì)量控制研究.中華中醫(yī)藥雜志,2013,04(28)(國家一級)周鵬,周惠芬,何昱,等.丹紅注射液對乳鼠腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用.中草藥,2013,44(19):2727-2731.(國家一級)ZefengWang,FahuanSong,JinhuiLi,etal.PETDemonstratesFunctionalRecoveryafterTreatmentbyDanhongInjectioninaRatModelofCerebralIschemic-ReperfusionInjury,Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2014
(2014),ArticleID
430757,9(SCI收錄,影響因子4.774)JuanChen,JunDeng,YuyanZhang,etal.Lipid-loweringeffectsofDanhonginjectiononhyperlipidemiarats.JournalofEthnopharmacology,2014,154(2):437-442.(SCI收錄,影響因子3.014)汪興宇,張宇燕,萬海同,等.參芎注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用.中國中藥雜志,2014,39(3):503-506.(國家一級)周鵬,周惠芬,何昱,等.羥基紅花黃色素A在Caco-2細胞單層模型的轉(zhuǎn)運研究.中草藥,2014
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