講課色譜分析法

講課色譜分析法第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一色譜法的基礎

色譜法(Chromatography)是一種物理或物理化學分離方法，將混合物中各組分分離后在線或離線分析的方法。色譜區(qū)別與其他分析方法的特點是什么？光譜分析法：判斷一種物質(zhì)是否存在，和此物質(zhì)的含量。色譜分析法：主要應用于混合物的分離。色譜法第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一主要內(nèi)容色譜法的來源和特點色譜流出曲線和相關概念色譜過程和基本原理第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一色譜法概述1903年俄羅斯植物學家Tsweet茨維特植物提取液CaCO3玻璃柱石油醚色譜色：顏色譜：圖譜創(chuàng)建1903第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

分析過程是離線的，不能連續(xù)進行。第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一現(xiàn)代色譜法的分離、分析過程是在線的，即連續(xù)進行的。不僅可用于分離有色物質(zhì)，同樣適用于無色物質(zhì)的分離。第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

色譜法的特點：優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”分離效率高----可將性質(zhì)相近的組分分開分離能力高----反復多次利用組分性質(zhì)差異將產(chǎn)生很好的分離靈敏度高----10-11～10-13

g，適于痕量分析分析速度快----幾到幾十分鐘可完成一個復雜樣品的分離分析應用范圍廣----氣體、液體、固體物質(zhì)；無機物或有機物也可通過化學衍生化進行色譜分離和分析缺點：對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用（GC-MS,LC-MS）

第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一石油醚流動相(Mobilephase)石油醚固定相(Stationaryphase)

CaCO3兩相混合物分離色譜分離過程實現(xiàn)色譜操作的基本條件：必須具備相對運動的兩相（固定相和流動相）第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一色譜分離過程---多次分配的過程

色譜過程是組分的分子在固定相和流動相間多次分配的過程。植物葉片的色素包含有多種成分，如胡蘿卜素、葉綠素A、葉綠素B、葉黃素，它們的化學結構不同，從而導致其化學性質(zhì)不同，并進一步導致混合物中不同組分在石油醚中的溶解能力及其對碳酸鈣的吸附能力有差別，這種差別就體現(xiàn)在不同的組分被石油醚攜帶著向下遷移的速度不同，遷移速度快的就先下來，遷移速度慢的就后下來，從而實現(xiàn)不同組分的分離。第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

色譜分離過程，是一個多次的吸附---溶解---再吸附---再溶解的過程，那么這樣一個反復多次的過程，它有一個什么樣的好處呢？組分的結構和性質(zhì)的微小差別，導致組分與固定相之間作用的性質(zhì)有微小差別，并進一步導致不同組分隨流動相向下遷移的速度有微小差別，那么這種微小的差別，是如何導致混合物的完全分離呢？關鍵就在于“多次的分配”，微小的差異經(jīng)多次分配過程被累加放大了，只要色譜柱足夠長，越往玻璃管下端，組分分離的越開。色譜分離過程---多次分配的過程第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一色譜分離法的原理？？？色譜分離的基礎：差速遷移組分的結構和性質(zhì)的微小差異與固定相作用有差異隨流動相移動的速度不等差速遷移第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一思考：茨維特所做的植物色素分離的實驗，實現(xiàn)了不同色素組分的分離，那么我們采用什么方法，可以將得到的各個組分進行分析、測定？

可以將分離之后得到的組分，采用紫外-可見光譜、紅外光譜、質(zhì)譜的方法進行分析，現(xiàn)代色譜分析法往往是在色譜柱后面加一個檢測器，當?shù)谝粋€組分流出色譜柱時，檢測器上就會產(chǎn)生一個信號峰，當?shù)诙€組分流出之后，會產(chǎn)生一個新的信號峰，當沒有組分流出時，產(chǎn)生的是一條平直的直線，沒有信號峰產(chǎn)生。色譜流出曲線和相關概念1.色譜流出曲線是由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜圖。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一2.

基線是柱中僅有流動相通過時，檢測器響應信號的記錄值?；€反映儀器（主要是檢測器）的噪音隨時間的變化。3.色譜峰是色譜流出曲線上突起的部分。根據(jù)色譜峰的性狀，可以將其分為正常色譜峰、拖尾峰和前延峰。對稱因子fs(synmetryfactor)，衡量色譜法的對稱性。色譜流出曲線和相關概念第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

1

保留時間（retentiontime,tR）：從進樣開始到某個組分色譜峰頂點的時間間隔稱為該組分的保留時間。單位為s或min。

2

死時間（deadtime,t0,

tM）：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)，分配系數(shù)為零的組分的保留時間稱為死時間，是流動相充滿輸液系統(tǒng)管路、色譜柱空隙及檢測池所需的時間。單位為s或min。

3

調(diào)整保留時間（adjustedretentiontime,t’R）：組分在固定相中停留的時間稱為調(diào)整保留時間。調(diào)整保留時間與保留時間和死時間有如下關系：

t’R=tR-t04.

定性參數(shù)第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一4相對保留值r2,1：兩組分的調(diào)整保留值之比稱為相對保留值，又稱選擇性因子，即：由于相對保留值只與柱溫、固定相性質(zhì)有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。5分配系數(shù)K：在一定的溫度、壓力下，組分在固定相和流動相中分配達到平衡時的濃度比，是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。

K=cs/cm

cs和cm

分別為組分在固定相和流動相中的濃度

分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學性質(zhì)決定的。它僅與固定相和溫度有關，但與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關。第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一5.

定量參數(shù)1峰高（peakheight;h）:色譜峰頂點與基線之間的垂直距離。2峰面積（peakarea;A）:色譜曲線與基線之間的包圍的面積。第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一1標準偏差（standarddeviation;）:正態(tài)色譜流出曲線上令拐點之間距離的一半，即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。越大，組分越分散，反之，越集中。2半高峰寬（peakwidth;W1/2）:峰高一半處對應的色譜峰寬度。

W1/2=2.354

3色譜峰底寬（peakwidth;Wb）:由色譜峰兩側拐點做切線與基線交點間的距離。6.區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾?是組分在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，反映了色譜操作條件的動力學因素。度量法有:標準偏差半峰寬W1/2色譜峰底寬Wb。第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

理論塔板數(shù)n(n有效)是衡量柱效的指標，反映了色譜分離過程動力學性質(zhì)。

常用色譜圖上兩峰間的距離衡量色譜柱的選擇性，其距離越大說明柱子的選擇性越好。柱子的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學性質(zhì)。

左圖反映了柱效能及選擇性對分離的影響。圖中（a）兩色譜峰峰形寬且嚴重相疊，表明柱效能和選擇性都很差。（b）兩色譜峰間距足夠大，但峰形很寬，說明選擇性好，但柱效能低。（c）分離最理想，說明選擇性好，柱效能也高。7.柱效和選擇性用于考察色譜系統(tǒng)的優(yōu)劣、好壞第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一8.

總分離效能指標：分離度分離度

(R)：它是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即注意：計算R時，保留時間和色譜峰底寬應采取相同的時間單位。

分離度R既反映了峰間距的大小，又反映了峰的寬窄，它全面衡量了色譜柱對難分離物質(zhì)對的分離效能，故把分離度叫做色譜柱的總分離效能指標。第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一上圖為不同分離度時色譜峰分離的程度當R<1時，兩峰總有部分重疊；當R=1時，兩峰能明顯分離；當R=1.5時，兩峰已完全分離，分離程度可達99.7%。通常，用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一組分完全分離的必須條件:下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。

圖中KA<KB，因此，A組分在色譜柱中遷移的速度更快，隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩色譜峰的間距逐漸變大，同時，每一組分的濃度輪廓（即區(qū)域?qū)挾龋┮猜儗?。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不利的，但不可避免。第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一組分完全分離的必須條件:組分的分配系數(shù)K必須有差異;

K=cs/cm

cs和cm

分別為組分在固定相和流動相中的濃度區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度;在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一從色譜流出曲線可以得到的