病理切片制作技術(shù)-課件

病理切片制作技術(shù)第一章組織的取材和固定方法第二章組織切片技術(shù)第三章蘇木精-伊紅染色方法1ppt課件第一章組織的取材和固定方法

病理標(biāo)本的檢查應(yīng)包括大體和顯微鏡下觀察二個(gè)方面，而正確的診斷往往取決于準(zhǔn)確的顯微鏡下觀察，因此，制片質(zhì)量的好壞將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至?xí)?lái)錯(cuò)誤的結(jié)果。近年來(lái)，免疫組織化學(xué)方法在病理學(xué)上應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)取材的要求也越來(lái)越高，不僅要求組織細(xì)胞的形態(tài)保存完整，而且要求最大程度的保存組織或細(xì)胞成分的抗原性?？乖圆皇軗p傷是一方面，還要求不能彌散，否則，對(duì)于抗原含量較少的標(biāo)本，抗原性完全喪失，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，影響病理診斷的準(zhǔn)確性，甚至抗原的定位也無(wú)從談起。2ppt課件第一節(jié)

取材

從大體標(biāo)本上按照病理檢查的目的和要求切取適當(dāng)大小的組織塊，供制片進(jìn)行顯微鏡檢查。一、取材時(shí)對(duì)送檢組織的要求二、取材三、取材時(shí)的注意事項(xiàng)四、冰凍切片取材3ppt課件一、取材時(shí)對(duì)送檢組織的要求送檢組織切取后應(yīng)立即放入10%福爾馬林溶液內(nèi)固定；尸檢標(biāo)本應(yīng)爭(zhēng)取在死亡后盡可能短的時(shí)間內(nèi)取材；有特殊要求（如細(xì)菌培養(yǎng)、結(jié)石的化學(xué)成分分析等）須事先聯(lián)系，在標(biāo)本未固定前進(jìn)行處理。4ppt課件二、取材

對(duì)送檢組織應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)檢查，根據(jù)診斷的需要，確定取材的部位和塊數(shù)；切取的組織要按不同部位分別給予不同的編號(hào)或標(biāo)記，以便鏡檢時(shí)查對(duì)。5ppt課件三、取材時(shí)的注意事項(xiàng)1．注意防止人為損傷

切取組織的刀具應(yīng)鋒利、??；切取組織塊時(shí)，避免前后拉動(dòng)或用力擠壓組織，避免使用有齒鑷，引起組織結(jié)構(gòu)的變形和損傷。2．標(biāo)本大小

經(jīng)修整后的組織大小以1.5cm1.5cm0.2-0.3cm為宜。3．取材時(shí)間

原則上應(yīng)盡快取材。4．注意包埋方向

需指定包埋面的應(yīng)作記號(hào)表明。如皮膚組織的包埋面應(yīng)與表面垂直，才能保證皮膚的各層結(jié)構(gòu)都能被觀察到。5．小標(biāo)本的處理方法

較小的標(biāo)本（如穿刺材料等）常常用易透水的薄紙包好，在取材時(shí)將標(biāo)本染上伊紅液，以免包埋過(guò)程中丟失。6．注意特殊情況

取材應(yīng)避免過(guò)多的壞死組織或凝血塊，組織塊上如有血液、粘液、糞便等污物，應(yīng)先用水沖洗干凈再取材。7．取材數(shù)量

不同的標(biāo)本取材的組織塊多少不同，原則上是凡是可疑處均應(yīng)取材。一般來(lái)講，除了病變的主體部分外，應(yīng)注意切取病變組織和正常組織交界處。8．清除多余部分

取材時(shí)應(yīng)注意清除組織周?chē)亩嘤嘀窘M織，否則會(huì)對(duì)以后的切片和觀察帶來(lái)一定的影響。9．核對(duì)

取材完畢，應(yīng)核對(duì)無(wú)誤，并簽署有關(guān)信息和記錄日期。10．組織存放

取材完畢，標(biāo)本應(yīng)按序存放，并加足固定液以備復(fù)查。

6ppt課件四、冰凍切片取材（一）取材

在詳細(xì)檢查的基礎(chǔ)上選取最有代表性的組織，必要時(shí)應(yīng)取2塊或更多組織塊。取材后應(yīng)立即用液氮速凍，然后在-70℃或-40℃低溫冰箱保存。

（二）注意事項(xiàng)

1．液氮速凍時(shí)，標(biāo)本盒不能直接浸入液氮，以免組織膨脹破碎。

2．新鮮組織不能放入-10℃冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞。

3．冷凍后的組織塊應(yīng)密封保存，防止脫水。

4．在組織塊復(fù)溫時(shí)，應(yīng)在37℃加溫速融，自然復(fù)溫將造成組織結(jié)構(gòu)破壞。7ppt課件第二節(jié)固定方法

將組織浸入某些化學(xué)試劑，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置，這一過(guò)程稱為固定。凡需病理檢驗(yàn)的各種組織都需經(jīng)過(guò)固定。一、固定的意義二、固定方法的選擇三、固定液8ppt課件一、固定的意義1．保持細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似，防止自溶與腐敗。

2．保持細(xì)胞內(nèi)的特殊成分與生活狀態(tài)時(shí)相仿。經(jīng)過(guò)固定，細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)等可沉淀或凝固，使其定位在細(xì)胞內(nèi)的原有部位，有利于其后物質(zhì)的確切定位。

3．便于區(qū)別不同組織成分。組織細(xì)胞內(nèi)的不同物質(zhì)經(jīng)固定后產(chǎn)生不同的折光率，對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力，經(jīng)染色后容易區(qū)別。

4．有利于切片。固定劑有硬化作用，可使細(xì)胞正常的半液體狀膠體變?yōu)榘牍腆w狀凝膠，使細(xì)胞組織硬度增加，便于制片。9ppt課件固定劑對(duì)組織細(xì)胞的不利影響1．影響常規(guī)染色。如用福爾馬林固定時(shí)，常有福爾馬林色素的異常沉積。2．固定造成物質(zhì)損失。不同的固定劑和固定方法會(huì)引起不同程度的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、粘多糖、脂類、核酸和低分子量物質(zhì)的損失，因此應(yīng)根據(jù)研究目的的不同選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┖凸潭ǚ椒?，以使所研究的物質(zhì)損失達(dá)到最小。3．組織皺縮。甲醛、福爾馬林固定的組織均有不同程度的皺縮。10ppt課件二、固定方法的選擇（一）細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分與固定劑的關(guān)系（二）常用的固定方法（三）固定時(shí)注意事項(xiàng)11ppt課件（一）細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分與固定劑的關(guān)系

組成細(xì)胞的主要成分是蛋白質(zhì)、脂類和糖類，根據(jù)研究目的不同選用不同的固定劑和固定方法，如要保存細(xì)胞內(nèi)糖原用Carnoy液固定，T淋巴細(xì)胞表面抗原為不穩(wěn)定抗原，極易被固定液破壞，因此常用冰凍切片進(jìn)行染色。12ppt課件（二）常用的固定方法

1．蒸汽固定法要固定組織中的可溶性物質(zhì)，一般選用蒸汽固定法；較小而薄的標(biāo)本，也可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于某些薄膜組織以及血液或細(xì)胞涂片的固定。

2．注射、灌注固定法某些組織塊體積過(guò)大或固定劑難以進(jìn)入內(nèi)部，或需要對(duì)整個(gè)臟器或動(dòng)物進(jìn)行固定。

3．細(xì)胞涂片的固定方法可采用浸入法和滴加法。用浸入法時(shí)，可將新鮮而濕潤(rùn)的涂片直接浸入固定液內(nèi)，如可能，應(yīng)每個(gè)病例單獨(dú)固定以免交叉污染。

4．微波固定法微波固定的組織具有核膜清晰、染色質(zhì)均勻、組織結(jié)構(gòu)收縮小的優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)用于病理診斷。但應(yīng)嚴(yán)格控制固定的溫度，否則會(huì)影響組織固定的質(zhì)量。13ppt課件（三）固定時(shí)注意事項(xiàng)1．固定液的量

固定組織時(shí)，固定液的量要充足，一般為組織塊總體積的4-5倍。而且應(yīng)在組織切取后立即或盡快放入適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ褐小?/p>

2．固定液的穿透性

一般固定液在24h內(nèi)不能穿透厚度大于2-3mm的實(shí)體組織或0.5cm的多孔疏松組織。

3．組織塊的大小

厚度可根據(jù)組織類型而不同，原則上不應(yīng)超過(guò)4mm，以3mm更為適宜。

4．固定時(shí)間

大多數(shù)組織應(yīng)固定24h。固定的時(shí)間與使用固定液的種類、組織塊大小、溫度等有關(guān)，不同的固定液有不同的固定時(shí)間，一般固定時(shí)間為3-24h。

5．固定溫度

大多數(shù)可在室溫（25℃）固定，在低溫固定時(shí)，固定時(shí)間應(yīng)相應(yīng)延長(zhǎng)。

6．加熱

加熱可使蛋白質(zhì)凝固，但一般不要求加熱，因?yàn)榧訜峥杉铀俳M織的自溶。

7．特殊固定

用于確診病變，保證在診斷時(shí)特殊結(jié)構(gòu)保存完好。如尿酸鹽結(jié)晶就需要特殊固定。14ppt課件三、固定液

用于固定組織的化學(xué)物質(zhì)稱為固定液或固定劑，一般由單一化學(xué)物質(zhì)組成者稱為固定劑或單純固定液；由多種化學(xué)物質(zhì)混合組成者稱為混合固定液或復(fù)合固定液。

（一）單純固定液（二）混合固定液15ppt課件（一）單純固定液1．甲醛（formaldehyde）2．重鉻酸鉀3．苦味酸4．鋨酸（四氧化鋨）5．丙酮6．酒精16ppt課件1．甲醛（formaldehyde）

市售的為40%的甲醛水溶液，也稱為福爾馬林（formalin）。此液久存自行分解，形成白色沉淀為副醛（三聚甲醛或多聚甲醛），可過(guò)濾后使用，但這種溶液中有甲酸產(chǎn)生，使溶液呈酸性，影響細(xì)胞核的染色，因此，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)的甲醛應(yīng)放入少量碳酸鎂或碳酸鈉，或用大理石中和。在40%甲醛中加入甲醇可阻止聚合作用。一般作為固定劑使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9:1）混合而成，實(shí)際上是4%甲醛。甲醛水溶液滲透能力強(qiáng)，固定均勻，組織收縮小，但經(jīng)乙醇脫水后收縮較大。甲醛為非沉淀性固定劑，不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通過(guò)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。因其價(jià)格較低，可用于固定和保存大標(biāo)本。長(zhǎng)時(shí)間固定的標(biāo)本，甲醛氧化產(chǎn)生的蟻酸在組織中與血紅蛋白形成棕色的福爾馬林色素，在制片前應(yīng)注意充分流水沖洗，否則可能影響染色效果。17ppt課件2．重鉻酸鉀

常用其1%-3%水溶液作為固定劑。未酸化的重鉻酸鉀不能使蛋白質(zhì)沉淀，但可以使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄?，保持其生活時(shí)的狀態(tài)，對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的固定較好，并且可固定類脂類物質(zhì)使其不溶于脂溶劑。用于固定高爾基體和線粒體有良好效果，但有溶解染色質(zhì)的缺點(diǎn)，染色質(zhì)保存相對(duì)較差。18ppt課件3．苦味酸

是一種強(qiáng)酸，易燃易爆。一般應(yīng)配成飽和溶液儲(chǔ)藏，常用其飽和溶液作固定劑。苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)，穿透慢，組織收縮明顯，但組織沒(méi)有明顯硬化，可使皮膚軟化，因此皮膚組織用苦味酸或其混合固定液固定時(shí)，易制作完整的切片。用含苦味酸的固定液固定組織時(shí)，時(shí)間不宜超過(guò)24h，固定后的組織應(yīng)盡快放入70%的酒精，并在酒精中滴加少量飽和碳酸鋰水溶液或濃氨水，有助于除去苦味酸固定產(chǎn)生的黃色。19ppt課件4．鋨酸（四氧化鋨）

為強(qiáng)氧化劑，不能與酒精、甲醛等混合。常用其1%-2%的水溶液作為固定液。是電鏡研究必需的固定劑，常用于后固定。鋨酸的滲透力極弱，易使組織變硬，固定的組織塊應(yīng)小，否則內(nèi)部固定效果不好。但延長(zhǎng)固定時(shí)間，組織的脆性增加，對(duì)染色不利。20ppt課件5．丙酮

可與水、醇、氯仿和醚等混合，可使蛋白質(zhì)沉淀，滲透力強(qiáng)，對(duì)核的固定差。廣泛用于酶組織化學(xué)方法中各種酶的固定（如磷酸酶、脂酶和氧化酶等）。作用基本與酒精相同。21ppt課件6．酒精

即乙醇。有固定兼脫水作用，固定速度較慢，易使組織變脆。用于固定的濃度為80%-95%。用于糖原的固定，如肝組織等糖原染色。酒精的滲透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白經(jīng)沉淀后，能溶于水，不利于染色體的固定。高濃度乙醇固定的組織硬化顯著，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)組織變脆，收縮明顯。酒精一般不作常規(guī)固定劑，用酒精固定時(shí)，常先用80%酒精固定數(shù)小時(shí)，再換95%酒精繼續(xù)固定。22ppt課件（二）混合固定液1．B-5固定液2．Bouin液3．Carnoy液4．Helly液5．甲醛-生理鹽水6．中性緩沖甲醛液7．中性甲醛液23ppt課件1．B-5固定液

即醋酸鈉-升汞-甲醛固定液。多用于固定淋巴組織。用該液固定的組織，在染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞處理。

24ppt課件2．Bouin液

常用于活檢標(biāo)本固定的固定液。用于固定大多數(shù)組織和器官，適用于結(jié)締組織染色。固定效果好，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。細(xì)胞核著色鮮明，但細(xì)胞質(zhì)著色較差。對(duì)脂肪的固定效果好，尤其適用于含脂肪的淋巴結(jié)、乳腺組織和脂肪瘤標(biāo)本的固定。固定液偏酸，對(duì)抗原有一定的損害，使組織收縮，不適宜于標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。固定后組織被染成黃色，需用70%-80%酒精洗滌。在酒精中加入飽和碳酸鋰水溶液有助于清除組織塊的黃色。25ppt課件3．Carnoy液

固定細(xì)胞漿和細(xì)胞核，對(duì)染色體的固定佳，顯示DNA和RNA效果較好。也常用于糖原和尼氏體的固定。不適宜于保存脂類，不適宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收縮作用，增加滲透力，可用作外膜致密不易滲透的組織的固定。該液固定速度快，3mm厚的組織塊1h即可固定，大塊材料最好不超過(guò)4h。26ppt課件4．Helly液

又成為Zenker福爾馬林液。對(duì)細(xì)胞質(zhì)固定效果好，顯示某些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特殊顆粒有獨(dú)特優(yōu)越性，對(duì)骨髓等造血器官的固定效果好，對(duì)心肌的閏盤(pán)保存也有良好效果。27ppt課件5．甲醛-生理鹽水應(yīng)用最廣泛的一種固定液，可保護(hù)脂類和細(xì)胞核。

28ppt課件6．中性緩沖甲醛液

為免疫組織化學(xué)最常用的固定液，對(duì)組織的穿透性好，組織收縮小。對(duì)大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，對(duì)細(xì)胞膜的通透性有影響，可能使某些大分子抗原失去活性。固定時(shí)間以24h以內(nèi)為宜。固定液配方：40%甲醛10ml，

0.01mol/LPBS（pH7.4）90ml。29ppt課件7．中性甲醛液是最常用的固定液之一，固定效果好。

30ppt課件第二章組織切片技術(shù)

在取材后，經(jīng)固定的標(biāo)本如組織塊較厚則應(yīng)進(jìn)行修整。有條件的應(yīng)根據(jù)組織塊大小分別進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋，包埋好的組織塊即可按需要進(jìn)行切片。

第一節(jié)組織的脫水、透明、浸蠟第二節(jié)組織的包埋和包埋方法第三節(jié)組織切片法31ppt課件第一節(jié)組織的脫水、透明、浸蠟一、脫水二、透明三、浸蠟四、骨和含鈣組織脫鈣法32ppt課件一、脫水

脫水是借某些溶媒置換組織內(nèi)水分的過(guò)程。組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混合，因此在浸蠟和包埋前必須進(jìn)行脫水。脫水劑必須能與水以任意比例混合，至于選用何種脫水劑，應(yīng)根據(jù)固定劑的要求，不要任意選用，否則無(wú)法得到滿意結(jié)果?，F(xiàn)將一些常見(jiàn)脫水劑及其性能和注意事項(xiàng)簡(jiǎn)介如下：

(一)酒精

(二)丙酮

（三）異丙醇

（四）正丁醇和叔丁醇

33ppt課件(一)酒精

是最常用的脫水劑之一。它可與水隨意混合，脫水能力較強(qiáng)，并且可硬化組織。酒精的穿透速度很快，對(duì)組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過(guò)度收縮，在用酒精作為脫水劑時(shí)，應(yīng)從低濃度開(kāi)始，然后再依次增加其濃度。一般從70％酒精開(kāi)始，經(jīng)80%、90％、95％酒精，爾后至無(wú)水酒精。對(duì)于少數(shù)柔嫩組織應(yīng)從50％或30％酒精開(kāi)始脫水。但也應(yīng)注意，對(duì)于一些需特殊處理的標(biāo)本，如進(jìn)行糖原和尿酸鹽結(jié)晶染色的標(biāo)本，為較好的保存物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（它們?cè)谒袝?huì)溶解消失），應(yīng)直接用無(wú)水酒精固定。經(jīng)無(wú)水酒精固定的組織，更換一次無(wú)水酒精脫水即可。一般情況下，組織經(jīng)上述處理，即可達(dá)到脫水要求。但大量組織塊同時(shí)進(jìn)行脫水時(shí)，為達(dá)到滿意的脫水效果，常經(jīng)過(guò)95％酒精和無(wú)水酒精各兩次。但注意組織塊在純酒精中放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，防止組織過(guò)度硬化造成切片困難。無(wú)水酒精經(jīng)應(yīng)用后，很難保證無(wú)水，因此應(yīng)在無(wú)水酒精容器內(nèi)加人硫酸銅吸收水分。硫酸銅遇水變藍(lán)后，即應(yīng)更換無(wú)水硫酸銅或更換純酒精。但放人容器的硫酸銅最好不要與組織塊接觸，可在硫酸銅表面加一塊濾紙。對(duì)于標(biāo)本量較大的單位，應(yīng)經(jīng)常更換酒精，對(duì)于標(biāo)本量少，又不經(jīng)常進(jìn)行切片的基層單位，可用以上方法。脫水的時(shí)間與組織塊大小有關(guān)，對(duì)于1.5cm×1.5cm×0.2-0.3cm的組織塊，一般脫水時(shí)間如下：

70％酒精數(shù)分鐘，80％、95％、95％、100％、l00％酒精各2-4h，將酒精在溫箱加溫可縮短脫水時(shí)間。對(duì)于小塊組織，80％-100％酒精30-45min即可。但對(duì)于結(jié)構(gòu)緊密的組織（如致密結(jié)締組織等）和大塊組織則不適用，應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。另外，脂肪組織和疏松結(jié)締組織應(yīng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間，在95％酒精中水分必須洗凈，脂肪必須溶解掉。否則石蠟不能滲入脂肪細(xì)胞和纖維組織，無(wú)法切出好的切片，而且染色時(shí)也容易脫片。這樣的組織蠟塊，因含有水分，經(jīng)與空氣接觸后即干燥出現(xiàn)凹陷。34ppt課件(二)丙酮

丙酮的脫水作用與酒精相似，但對(duì)組織塊的收縮作用比酒精更嚴(yán)重，因此一般很少單純應(yīng)用丙酮作脫水劑。在快速脫水或固定兼脫水時(shí)有時(shí)應(yīng)用，脫水時(shí)間約l-3h。丙酮可作為染色后的脫水劑，用于DNA和RNA染色。35ppt課件（三）異丙醇

是酒精的良好代用品，不含水，可代替無(wú)水酒精使用。脫水后組織收縮小，對(duì)組織的硬化作用也較弱。對(duì)火棉膠和染料不溶，因此不能用于火棉膠包埋和染料配制。在常規(guī)制片中很少應(yīng)用。36ppt課件（四）正丁醇和叔丁醇

正丁醇是無(wú)色液體，脫水能力較弱，可和水、酒精和石蠟混合，因此這種脫水的組織塊可直接浸蠟和包埋。叔丁醇無(wú)毒，可與水、酒精、二甲苯混合。可單獨(dú)使用，也可與酒精混合使用，是目前常用的一種脫水劑。與正丁醇相比，它不易使組織收縮或變硬，而且脫水后可不經(jīng)透明直接浸蠟，浸蠟前先經(jīng)過(guò)叔丁醇和石蠟1:1混合液。電鏡標(biāo)本制作時(shí)常用作中間脫水劑。37ppt課件二、透明

為使石蠟?zāi)芙私M織塊，組織脫水后，必須經(jīng)過(guò)一種既能與酒精相混合，又能溶解石蠟的溶劑，通過(guò)這種溶劑的媒介作用，而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。在這一過(guò)程中，因組織塊中的水分被溶劑（如二甲苯）取代，其折射指數(shù)接近于組織蛋白的折光指數(shù)，組織塊變得透亮，因此稱之為透明。組織染色后，也要進(jìn)行透明。用作透明劑的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、環(huán)己酮等。

（一）二甲苯（二）苯和甲苯（三）氯仿38ppt課件（一）二甲苯

是常用的透明劑，其折射指數(shù)（refractiveindex，RI）為1.50。它對(duì)組織的收縮性強(qiáng)，易使組織變硬變脆。因此，組織塊（3-4mm）在二甲苯中一般30min即可使組織透明，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。組織塊可先經(jīng)過(guò)1:1無(wú)水酒精、二甲苯混合液處理，再浸人二甲苯。切片染色后進(jìn)行透明，不會(huì)使苯胺染料退色。如進(jìn)入二甲苯時(shí)出現(xiàn)渾濁，說(shuō)明脫水不充分。39ppt課件（二）苯和甲苯

苯（RI=1.50）和甲苯（RI＝1.50）與二甲苯的性質(zhì)相似，對(duì)組織收縮較小，與二甲苯相比，不易使組織變脆。但透明速度慢且揮發(fā)快，吸人苯易引起中毒，操作應(yīng)在通風(fēng)櫥或空氣較流通處進(jìn)行。苯對(duì)組織的收縮小，不引起組織硬化變脆，適于處理致密結(jié)締組織、肌肉及腺體等組織的透明。脫水至無(wú)水酒精時(shí)即可進(jìn)入純苯透明，可長(zhǎng)時(shí)間停留。甲苯多用于切片染色后的透明。40ppt課件（三）氯仿

氯仿也不易使組織變脆變硬，但透明能力比二甲苯差，其RI＝1.45，且極易揮發(fā)和易吸收水分，用作透明劑時(shí)，多用于大塊組織（1cm）的透明，而且應(yīng)在容器內(nèi)放置無(wú)水硫酸銅?？傮w比較來(lái)看，以二甲苯最為常用，而且一般工業(yè)用二甲苯即可達(dá)到透明效果。用二甲苯透明時(shí)，一般經(jīng)過(guò)2-3次純二甲苯溶液，每次10-15min。同時(shí)也應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及液體的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。如腦組織和凝血塊，應(yīng)縮短在二甲苯內(nèi)的留置時(shí)間。而肌肉組織和胃腸組織則應(yīng)延長(zhǎng)。41ppt課件三、浸蠟

組織經(jīng)透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱浸蠟。為使石蠟充分滲入組織塊中，常需經(jīng)過(guò)2-3次石蠟浸漬才能完成。在第一次石蠟中加入少量二甲苯或用低熔點(diǎn)的軟蠟，爾后再浸入高熔點(diǎn)的硬蠟效果更好。一般用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52-56℃。但具體應(yīng)用時(shí)還應(yīng)考慮當(dāng)時(shí)的情況，一般在夏天氣溫較高的情況下，應(yīng)采用高熔點(diǎn)的硬蠟，而在氣溫較低的季節(jié)，應(yīng)用低熔點(diǎn)的石蠟，這樣有利于切片制作。組織塊總的浸蠟時(shí)間約3-4h。當(dāng)然也應(yīng)根據(jù)組織塊的種類和大小以及溫度情況加以靈活掌握。時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易造成組織塊脆硬，時(shí)間不足，也難制作良好的切片。

42ppt課件對(duì)于一般的動(dòng)物組織，脫水、透明和浸蠟時(shí)間如下：

①75％酒精長(zhǎng)短不定

②85％酒精120-300min③95％酒精I(xiàn)和II120-300minll

④無(wú)水酒精I(xiàn)、II和III30min⑤無(wú)水酒精I(xiàn)II60-120min⑥二甲苯I和II30min⑦二甲苯III60min⑧56-58℃石蠟30min⑨56-58℃石蠟60-120min⑩56-58℃石蠟120-180min43ppt課件四、骨和含鈣組織脫鈣法

骨、牙齒和有鈣化的組織在充分固定后，應(yīng)進(jìn)行脫鈣處理。脫鈣組織的厚度不宜超過(guò)4mm。牙齒和骨可先鋸開(kāi)，而后用砂輪磨成薄片脫鈣，有鈣化的組織再經(jīng)脫鈣液浸泡短時(shí)即可。組織脫鈣有多種方法，常用的有以下幾種：

（一）酸性溶液脫鈣法（二）螯合劑脫鈣法（三）脫鈣后處理44ppt課件（一）酸性溶液脫鈣法1．硝酸脫鈣法

常用脫鈣液，①10％硝酸水溶液（加少量尿素），②硝酸10ml和10％甲醛90ml的混合液。組織塊經(jīng)甲醛固定后，先用5％硝酸溶液脫鈣。每日更換脫鈣液，早晚各一次，直至用針刺入組織無(wú)阻力感為止，一般2-3天，組織若柔軟性較好，用鑷子可彎曲120°而回彈，說(shuō)明脫鈣完全。如不夠，可延長(zhǎng)時(shí)間，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將影響染色。流水沖洗24h即可。有時(shí)對(duì)脫鈣液進(jìn)行鈣鹽試驗(yàn)以確定脫鈣是否完全。可取用過(guò)的脫鈣液5m1，加濃氨水lml，充分混合后，加草酸銨飽和水溶液0.1m1，若有沉淀生成，說(shuō)明脫鈣還不充分，若液體透明，說(shuō)明已完全脫鈣。

2．鹽酸脫鈣法

常用的脫鈣液，①鹽酸8.5ml，甲酸5m1，氯化鋁7g，蒸餾水100ml。②鹽酸和甲酸各20m1，蒸餾水100ml。方法同上。45ppt課件（二）螯合劑脫鈣法1．此法對(duì)組織無(wú)損傷，但脫鈣速度慢。組織內(nèi)酶的活性保留，可用于組織化學(xué)染色的小塊骨組織。對(duì)組織抗原性的損傷也較小，因此用于免疫組織化學(xué)染色也較為理想，骨組織超薄切片在預(yù)固定后常用EDTA進(jìn)行脫鈣處理。2．用EDTA（乙二胺四乙酸）溶液：EDTA10g，溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）或Tris緩沖液（pH6.8-7.0）100ml中。3．薄片組織放人EDTA溶液脫鈣，4天更換1次新液，需數(shù)周才能脫鈣完畢。4．脫鈣后的組織，經(jīng)流水沖洗以除去組織中的EDTA，而后按常規(guī)處理。

46ppt課件（三）脫鈣后處理1．脫鈣后的組織用流水沖洗15-30min，也可先用碳酸鈉中和。2．修去鋸面的薄層組織，切成適當(dāng)大小的組織塊，常規(guī)處理，注意脫水應(yīng)充分，否則組織易脆，切片困難。47ppt課件第二節(jié)組織的包埋和包埋方法

組織塊經(jīng)過(guò)浸透劑（石蠟、火棉膠、樹(shù)脂等）浸透，用包埋劑（石蠟、火棉膠、樹(shù)脂等）包起的過(guò)程稱包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成含組織的塊。經(jīng)包埋后，可使組織達(dá)到一定的硬度和韌度，有利于切成薄片。不同的包埋劑，其包埋方法不同，分別簡(jiǎn)述如下。

一、常規(guī)石蠟包埋法二、石蠟半薄切片包埋法

48ppt課件一、常規(guī)石蠟包埋法

在進(jìn)行石蠟包埋時(shí)，先將熔化的石蠟倒入包埋框，爾后用加溫的鑷子將浸蠟的組織塊放人。在石蠟中有雜物時(shí)應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再使用。包埋時(shí)首先注意有無(wú)特殊的包埋面（如分層組織，皮膚等），包埋面必須平整。包埋溫度不應(yīng)過(guò)高，否則易造成組織塊的燙傷，影響診斷。另外，包埋蠟的溫度與組織塊的溫度應(yīng)接近，不然會(huì)引起組織塊與周?chē)灥拿摿?。包埋一般?6℃的石蠟，也應(yīng)根據(jù)氣溫條件作相應(yīng)調(diào)整，以組織塊具有合適的硬度、能切出高質(zhì)量的切片為標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)注意過(guò)硬的組織一般用較硬的石蠟包埋，而柔嫩的組織多應(yīng)選用硬度低的石蠟。在包埋完畢，蠟塊稍凝后，可移入冷水或冰箱加速凝固。工業(yè)石蠟，密度疏松，應(yīng)反復(fù)多次熔化和冷卻，使其密度增加。49ppt課件二、石蠟半薄切片包埋法

制作半薄切片的組織，應(yīng)經(jīng)固定液充分固定，根據(jù)組織類型進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。1．穿刺組織和細(xì)小的話檢組織

95％酒精脫水2h，每30min更換新液一次；無(wú)水酒精2h，每30min更換新液一次；無(wú)水酒精-氯仿等量混合液30min；氮仿透明2h，每30min更換新液一次；60~62℃石蠟浸蠟3h，每lh更換新液1次。2．一般軟組織（厚度不超過(guò)2mm）

95％酒精2h，每30min更換新液一次；無(wú)水酒精4h，每1h更換新液一次；無(wú)水酒精-氮仿等量混合液1h；氯仿透明3h，每1h更換新液一次；60~62℃石蠟浸蠟3h，每1h更換新液一次。3．皮膚、平滑肌瘤等韌性較大的組織（厚度2mm)

95％酒精2h，每lh更換新液一次；無(wú)水酒精2h，每lh更換新液一次；松脂醇（松節(jié)油也可代替）18~24h，更換2次；氯仿透明3h，每1h更換新液一次；60~62℃石蠟浸蠟4h。在60~62℃石蠟中加入松香（占總量4％~6％）混合調(diào)勻后用作包埋劑，包埋前組織可先在其中浸透30~60min。50ppt課件第三節(jié)組織切片法

組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹(shù)脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動(dòng)磨刀儀器等。以下以石蠟切片法為例加以敘述。組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過(guò)程稱為石蠟切片法。為現(xiàn)在病理診斷常用的制作切片方法。在切片前應(yīng)先切去標(biāo)本周?chē)^(guò)多的石蠟（此過(guò)程稱為“修塊”），但也不能留得太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時(shí)分片困難。一般切4-6m厚的切片，特殊情況可切1-2m。要觀察病變的連續(xù)性可制作連續(xù)切片。除此之外，石蠟包埋的組織塊便于長(zhǎng)期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。

一、切片前的準(zhǔn)備二、切片制作過(guò)程三、切片的注意事項(xiàng)51ppt課件一、切片前的準(zhǔn)備1．固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成蠟塊。高質(zhì)量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。檢查切片刀是否鋒利，簡(jiǎn)便的方法是用頭發(fā)在刀鋒上碰一下，如一碰即斷，說(shuō)明刀鋒鋒利。用顯微鏡觀察可確定刀口是否平整，有無(wú)缺口。2．準(zhǔn)備充足的經(jīng)過(guò)處理的清潔載玻片和恒溫烤片裝置，大、中號(hào)優(yōu)質(zhì)狼毫毛筆和鉛筆。52ppt課件二、切片制作過(guò)程1．預(yù)先修好的組織塊先在冰箱中冷卻，而后裝在切片機(jī)固定裝置上。將切片刀裝在刀架上，刀刃與蠟塊表面呈5o夾角。將蠟塊固定，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，并移動(dòng)刀架或蠟塊固定裝置，使蠟塊與刀刃接觸。2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，使用時(shí)左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪。先修出標(biāo)本，直到組織全部暴露于切面為止，但小標(biāo)本注意不要修得太多，以免無(wú)法切出滿意的用于診斷的切片，大標(biāo)本應(yīng)注意切全。切出蠟片后，用毛筆輕輕托起，爾后用眼科鑷夾起，正面向上放人展片箱（40℃左右)，待切片展平后，即可進(jìn)行分片和撈片。為減少切片刀與組織塊在切片過(guò)程中產(chǎn)生的熱量，使石蠟保持合適的硬度，切片時(shí)可經(jīng)常用冰塊冷卻切片刀和組織塊，尤其在夏季高溫季節(jié)更為必要。3．輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切取組織，是由下向上切，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端(如皮膚組織，應(yīng)將表皮部分向上。而胃腸等組織，應(yīng)將漿膜面朝上)。4．撈片時(shí)注意位置，要留出貼標(biāo)簽的空間，并注意整齊美觀。撈起切片后，立即寫(xiě)上編號(hào)。5．切片撈起后，在空氣中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱內(nèi)烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝塊和皮膚組織應(yīng)及時(shí)烤片。但對(duì)腦組織（較大組織等）待完全晾于后，才能進(jìn)行烤片。否則可能產(chǎn)生氣泡影響染色。53ppt課件三、切片的注意事項(xiàng)1．組織的取材和固定

2．組織脫水、透明和浸蠟

3．切片

4．切片刀和切片機(jī)

5．特殊要求切片的制作54ppt課件1．組織的取材和固定

取材時(shí)，組織塊的大小厚薄應(yīng)適當(dāng)，過(guò)大、過(guò)厚的組織，固定液不易滲透，易引起固定不良。過(guò)小、過(guò)薄的組織，在固定和脫水的過(guò)程中易變硬或產(chǎn)生彎曲扭轉(zhuǎn)，同樣影響切片質(zhì)量。陳舊、腐敗和干枯的組織不宜制作切片。用陳腐組織制成的切片，往往核漿共染，染色模糊，組織結(jié)構(gòu)不清，無(wú)法進(jìn)行觀察。固定不及時(shí)和固定不當(dāng)?shù)慕M織，染色時(shí)常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺，輪廓不清，出現(xiàn)不同程度的片狀發(fā)白區(qū)。組織固定時(shí)，固定液的量應(yīng)充足，至少要在4倍以上，同時(shí)注意組織塊不要與容器粘連。至于組織固定的時(shí)間，根據(jù)具體情況加以掌握。55ppt課件2．組織脫水、透明和浸蠟

組織脫水用的各級(jí)酒精，應(yīng)保證相應(yīng)濃度，以便組織脫水徹底。但無(wú)水酒精中，組織塊放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則組織過(guò)硬，切片困難。遇到此情況，可將組織浸在香柏油中軟化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蠟和包埋。脫水酒精，尤其是無(wú)水酒精中混有水分時(shí)，組織脫水不干凈。經(jīng)二甲苯時(shí)，組織也無(wú)法透明，呈現(xiàn)渾濁。此時(shí)應(yīng)將組織在新的酒精中重新脫水。二甲苯透明也應(yīng)充分，否則不利于石蠟的浸透。但組織在二甲苯內(nèi)的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格掌握，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)組織易碎，也無(wú)法切出好的切片、時(shí)間不足，則石蠟不易浸透。浸蠟的溫度也不宜過(guò)高，時(shí)間長(zhǎng)短也應(yīng)加以控制。

總之，組織脫水、透明和浸蠟對(duì)于切片質(zhì)量都有一定影響，組織脫水、透明和浸蠟過(guò)度，組織塊變硬變脆，因此對(duì)于小塊組織或小動(dòng)物標(biāo)本應(yīng)注意時(shí)間。但若時(shí)間不夠，組織塊硬化不夠，也不利于切片和染色，對(duì)診斷帶來(lái)困難。因此應(yīng)注意各具體環(huán)節(jié)的操作，并注意保證各種試劑的質(zhì)量。56ppt課件3．切片

組織塊固定不牢時(shí)，切片上常形成橫皺紋。切片刀要求鋒利且無(wú)缺口，切片自行卷起多由切片刀不鋒利所致，切片刀有缺口時(shí)，易造成切片斷裂、破碎和不完整。骨組織切片時(shí)，用重型刀較好。57ppt課件4．切片刀和切片機(jī)

切片刀放置的傾角以20o-30o為好。傾角過(guò)大切片上卷，不能連在一起。過(guò)小則切片皺起。應(yīng)注意維護(hù)切片機(jī)，防止因螺絲松動(dòng)產(chǎn)生震動(dòng)，切片時(shí)會(huì)造成切片厚薄不均。遇硬化過(guò)度的肝、腦、脾等組織時(shí)，應(yīng)輕輕切削，防止組織由于展動(dòng)產(chǎn)生空洞現(xiàn)象。58ppt課件5．特殊要求切片的制作

石蠟切片雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)酒精和二甲苯等有機(jī)溶劑處理，因此很易造成組織內(nèi)抗原性的喪失，在用于免疫組織化學(xué)染色時(shí)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因而有人采用冷凍干燥包埋法，即將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)在真空和低溫條件下除去組織內(nèi)的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的組織，而后在進(jìn)行浸蠟、包埋和切片。此法可保存組織內(nèi)的可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，減少抗原的丟失。用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記和放射自顯影。59ppt課件第三章蘇木精-伊紅染色方法

第一節(jié)蘇木精—伊紅染色的基本原理第二節(jié)蘇木精—伊紅染色方法第三節(jié)染色液的配制第四節(jié)染色中注意事項(xiàng)60ppt課件第一節(jié)蘇木精-伊紅染色的基本原理

蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色方法，簡(jiǎn)稱HE染色方法，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的細(xì)胞與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。教學(xué)和研究都是用HE染色方法觀察正常和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此病理學(xué)工作者必需學(xué)習(xí)和掌握這種染色方法。

一、細(xì)胞核染色的原理二、細(xì)胞漿染色的原理三、染色中二甲苯、酒精和水洗作用四、分化和藍(lán)化作用61ppt課件一、細(xì)胞核染色的原理

細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。62ppt課件二、細(xì)胞漿染色的原理

細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物，細(xì)胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當(dāng)調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4．7-5．0時(shí)，腦漿對(duì)外不顯電性，此時(shí)酸或堿性染料不易染色。當(dāng)PH調(diào)至6．7-6．8時(shí)，大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負(fù)電荷的陰離子，可與帶正電荷的染料染色，同時(shí)胞核也被染色，胞核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點(diǎn)以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽(yáng)離子)，就可被帶負(fù)電荷(陰離子)的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷(陽(yáng)離于)結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。伊紅是細(xì)胞漿的良好染料。

63ppt課件三、染色中二甲苯、酒精和水洗作用1．二甲苯的作用石蠟切片的常規(guī)染色必須先用二甲苯脫去切片中的石蠟，其作用是二甲苯可以溶解切片中的石蠟，以使染料易于進(jìn)入細(xì)胞和組織，因?yàn)槭灥拇嬖诜恋K水和染料進(jìn)人細(xì)胞。染色后二甲苯起透明切片的作用，以利于光線的透過(guò)。

2．酒精的作用酒精用于蘇木精染色前由高濃度向低濃度逐漸下降處理切片，是為了洗脫用于脫蠟的二甲苯，使水能進(jìn)人細(xì)胞和組織中，因?yàn)榧兙凭梢院投妆交ト?，二甲苯?jīng)過(guò)二次純酒精的洗滌完全被除去，再經(jīng)過(guò)95％、80％酒精使水分逐漸進(jìn)人切片，以免引起細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的人工改變。伊紅染色以后的酒精由低濃度80％、90％、95％酒精向l00％酒精逐漸過(guò)度是為了逐漸脫去組織中的水份，為二甲苯進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)造條件，這時(shí)必須徹底脫水，否則二甲苯不能進(jìn)入細(xì)胞，組織切片透明度達(dá)不到光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)透光度的要求，在顯微鏡下不能顯示清晰的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。3．水洗的作用在脫蠟經(jīng)酒精處理之后，用水洗切片，使切片中進(jìn)入水，才能使蘇木精染液進(jìn)入細(xì)胞核中，使細(xì)胞核染色。染色之后的水洗作用是為洗去未與切片結(jié)合的染液。分化以后的水洗則是為了除去分化液和脫下的染料，中止分化作用。在伊紅染色之后也可以用水洗去未結(jié)合的染液，以防止大量伊紅染波進(jìn)入脫水的酒精中。64ppt課件四、分化和藍(lán)化作用1．分化作用蘇木精染色之后，用水洗去未結(jié)合在切片中的染液，但是在細(xì)胞核中結(jié)合過(guò)多的染料及胞漿中吸附的染料必須用1％鹽酸酒精溶液脫去，才能保證細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色的分明，把這個(gè)過(guò)程稱為染色的分化作用。因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離，分化不可過(guò)度。

2．藍(lán)化作用分化之后蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下則處于藍(lán)色離子狀態(tài)而呈藍(lán)色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細(xì)胞核變呈籃色，稱藍(lán)化作用。一般多用自來(lái)水浸洗即可變藍(lán)，也可用稀氨水或溫水變藍(lán)。65ppt課件第二節(jié)蘇木精伊紅染色方法一、人工操作的蘇木精伊紅染色方法二、冰凍切片的蘇木精伊紅染色66ppt課件一、人工操作的蘇木精伊紅染色方法

1．染色步驟（1）二甲苯I脫蠟10min

（2）二甲苯II脫蠟5min

（3）無(wú)水乙醇洗去二甲苯lml×2次。（4）95％酒精lmin

（5）90％酒精1min

（6）85％酒精lmin

（7）自來(lái)水洗2min

（8）蘇木精染色1min至5min

（9）自來(lái)水洗lmin

（10）1％鹽酸酒精分化20s

（11）自來(lái)水洗lmin

（12）稀氨水（1％）反藍(lán)30s。自來(lái)水洗或蒸餾水洗1min

（13）伊紅染色20s至5min

（14）自來(lái)水洗30s。（15）85％酒精脫水20s

（16）90％酒精30s

（17）95％酒精I(xiàn)1min

（18）95％酒精I(xiàn)I1min

（19）無(wú)水乙醇I2min

（20）無(wú)水乙醇II2min

（21）二甲苯I2min

（22）二甲苯II2min

（23）二甲苯III2min

（24）中性樹(shù)膠或加拿大樹(shù)膠封片

2．染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。鈣鹽和各種微生物也可染成藍(lán)色或紫藍(lán)色。

67ppt課件二、冰凍切片的蘇木精伊紅染色

1．恒冷箱冰凍切片，粘貼在載玻片上，用95％酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自來(lái)水洗

2．蘇木精染色1-2min3．自來(lái)水洗30s4．1％鹽酸酒精分化20s5．自來(lái)水洗20s6．稀氨水20s7．自來(lái)水洗20s8．伊紅染色20s-1min9．自來(lái)水洗10s19．85％酒精20s11．90％酒精30s12．95％酒精1min1