種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范

種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于曾祖代、祖代及非免疫父母代種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病的凈化。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于疫苗免疫雞場(chǎng)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T17999.4SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗(yàn)NY/T553禽支原體PCR檢測(cè)方法NY/T1168畜禽糞便無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T5030無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則DB34/T2160雞毒支原體感染防治技術(shù)DB63/T1652病害動(dòng)物及病害動(dòng)物產(chǎn)品無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)程T/CVMA1禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。種雞breedingchicken按照動(dòng)物育種四系配套的原則，將雞的遺傳譜系分為曾祖代、祖代、父母代和商品代，只有曾祖代的雞（原種雞）可以自繁、自養(yǎng)和留種，而其他后代均必須按照四系配套的原則進(jìn)行育種，且不能留做和它同級(jí)的種。種雞（祖代和父母代）是經(jīng)過(guò)不斷地選種和選育，具有一定的生產(chǎn)、生長(zhǎng)和遺傳穩(wěn)定性，能夠提供子代，且按照育種組織制訂的標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)收和鑒定并承認(rèn)的雞品種。按經(jīng)濟(jì)用途分為蛋用型、肉用型、肉蛋兼用型和觀賞型。家禽疫病凈化poultrydiseaseeradication在一個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)或指定的養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)，通過(guò)持續(xù)不斷的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和淘汰患病禽群或帶菌禽群，并通過(guò)及時(shí)淘汰感染禽群的方法，以實(shí)現(xiàn)根除某種家禽疾病的過(guò)程。診斷臨床診斷雞毒支原體病參照DB34/T2160的臨床癥狀和病理變化。滑液囊支原體病流行特點(diǎn)感染通常見(jiàn)于4周～16周齡的雞。雞群的患病率一般為5%～10%，病死率不超過(guò)10%。臨床癥狀引起的呼吸道癥狀不明顯，受侵害部位在關(guān)節(jié)的滑液囊膜及腱鞘。出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、熱痛、胸部龍骨上水皰、跛行甚至站不起來(lái)，從而造成雛雞或青年雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻，產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能下降，蛋殼質(zhì)量變差、易碎。最初癥狀是雞冠蒼白、生長(zhǎng)遲緩和關(guān)節(jié)腫脹，跗關(guān)節(jié)和爪墊是主要感染部位。隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)雞冠萎縮、羽毛粗亂、跛行甚至站立不起。呼吸系統(tǒng)感染滑液囊支原體癥狀輕微，但感染禽是帶菌者。成年雞群感染多表現(xiàn)為蛋殼質(zhì)量變差、易碎。病理變化病禽主要表現(xiàn)為滑膜炎。在病情較輕時(shí)，在腫脹的關(guān)節(jié)部位可見(jiàn)到有多量黏稠的滲出液。嚴(yán)重時(shí)，可見(jiàn)到腱鞘處有黃白色囊狀物，內(nèi)有白色黏液，關(guān)節(jié)滑液囊或腳墊內(nèi)有黏液性呈灰白色的乳酪樣滲出物，有時(shí)關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)糜爛。趾關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)可見(jiàn)有異嗜性白細(xì)胞和纖維素浸潤(rùn)。病原分離培養(yǎng)對(duì)可疑雞群進(jìn)行支原體病原的分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基配制、分離部位及培養(yǎng)條件等參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。血清學(xué)檢測(cè)對(duì)種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體凝集抗體的檢測(cè)，參照GB/T17999.4進(jìn)行，在2min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性；2min內(nèi)不凝集者為陰性；介于上述兩者之間為可疑，進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)，如仍為可疑，判為陽(yáng)性（見(jiàn)附錄B）。核酸檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）方法可任選其一。試劑除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。2×TaqPCRMasterMixⅡ。10×LAMPAmplificationBuffer，-20℃保存。10mmol/LBetaine溶液：配制見(jiàn)附錄A.1，-20℃保存。BstDNAPolymerase（6U/μL），-20℃保存，避免反復(fù)凍融。MgSO4（100mmol/L）：配制見(jiàn)附錄A.2，-20℃保存。dNTP混合液（10mmol/L），-20℃保存，避免反復(fù)凍融。SYBRGreenⅠ核酸染料，4℃保存。DNAMarker2000，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。開(kāi)蓋后于4℃保存不超過(guò)3個(gè)月。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用的MG標(biāo)準(zhǔn)菌株為F-36株，采用的MS標(biāo)準(zhǔn)菌株為GX11-T株。儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。微量移液器：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。電子天平：精度0.01mg。恒溫水浴鍋或恒溫金屬浴。渦旋儀。生物安全柜。電泳儀。紫外透射反射分析儀。樣品處理取咽喉棉拭子。將棉拭子樣品懸浮于1mLPBS溶液中，混勻成懸浮液。DNA提取將棉拭子樣品制成的混懸液4000r/min離心5min，將離心后的上清置于新的1.5mL離心管中，在4℃條件下，12000g離心20min，棄去上清液，并將沉淀物重新懸浮在25μL～50μL的0.1%焦碳酸二乙酯（DEP）水中。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法雞毒支原體和滑液囊支原體的PCR檢測(cè)方法使用的引物及反應(yīng)條件等參考NY/T553。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）方法引物依據(jù)雞毒支原體（MG）的mgc2基因序列和滑液囊支原體（MS）的16SrRNA序列，分別設(shè)計(jì)LAMP引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度約200bp。MG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’MG-B3：5’-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’MG-BIP：5’-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’MS-F3：5’-GCATTAAGCGGATCGGTT-3’MS-B3：5’-AACTGCTGCATCAAGAGC-3’MS-FIP：5’-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’MS-BIP：5’-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’LAMP反應(yīng)條件所采用的試劑盒反應(yīng)體系見(jiàn)表1。禽支原體LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)組分體積10×AmplificationbufferⅡ2.5μLdNTP混合液（10mmol/L）4.0μLF3/B3（10μmol/L）0.5μL×2FIP/BIP（30μmol/L）1μL×2Betaine（10mmol/L）2μLDNA1μLBstDNAPolymerase（6U/μL）1μLMgSO4（100mmol/L）1μLddH2010.5μL取DNA模板1-5μL置于分別加入雞毒支原體/雞滑液囊支原體LAMP引物已配置好的上述試劑盒體系內(nèi)，在管蓋內(nèi)壁加1mL1000×SYBRGreenⅠ，通過(guò)染料液滴本身的液體表面張力使得染料附著在管蓋上，從而避免染料在反應(yīng)過(guò)程中接觸反應(yīng)液抑制反應(yīng)，關(guān)閉管蓋時(shí)需注意避免用力過(guò)大防止染料滴入反應(yīng)液。置于63℃水浴鍋中，反應(yīng)60min，80℃作用10min終止反應(yīng)。結(jié)果判定瞬時(shí)離心LAMP反應(yīng)管，使管蓋內(nèi)側(cè)壁的SYBRGreenⅠ核酸染料與LAMP反應(yīng)體系充分混勻。在自然光照下，陰性反應(yīng)管不發(fā)生顏色變化，為橘紅色，陽(yáng)性反應(yīng)管內(nèi)液體變?yōu)辄S色。反應(yīng)管置于紫外透射反射分析儀下，陰性反應(yīng)管不顯現(xiàn)熒光，陽(yáng)性反應(yīng)管發(fā)出明亮的黃綠色熒光（見(jiàn)附錄C）。凈化檢測(cè)規(guī)程曾祖代和祖代雞出殼雛雞的檢測(cè)與處置雛雞飼養(yǎng)管理參照T/CVMA1的方法，將種蛋隔離孵化，出殼后小批量隔離飼養(yǎng)，減少孵出的雛雞相互之間的感染機(jī)會(huì)。樣品的收集采集出殼后的雛雞咽喉棉拭子，置于預(yù)先做好標(biāo)記的1.5mL滅菌離心管，離心管中預(yù)先加入0.5mL樣品稀釋液，充分震蕩搖均。每次對(duì)一只雞采樣后，應(yīng)注意更換一次性手套或?qū)﹄p手進(jìn)行消毒，方可進(jìn)行另一只雞采樣，避免產(chǎn)生交叉的污染。核酸檢測(cè)和病原鑒定將采集到的樣品一分為二。一部分樣品用于進(jìn)行PCR或LAMP檢測(cè)（二選其一）。PCR按照NY/T553禽支原體PCR檢測(cè)方法進(jìn)行。LAMP檢測(cè)按照4.4.6方法進(jìn)行。一旦發(fā)現(xiàn)樣品的PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性，則立即對(duì)可疑樣品的備份按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)進(jìn)行病原分離和鑒定。檢測(cè)雞群處置淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性以及病原分離陽(yáng)性的雞，對(duì)于PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性但病原分離陰性的雞也應(yīng)淘汰，同時(shí)淘汰同居雞。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞群應(yīng)維持小群飼養(yǎng)。育成期的檢測(cè)和處置雞群臨床觀察觀察雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑育成期雞進(jìn)行淘汰?？贵w檢測(cè)對(duì)全群100%采血，進(jìn)行SPA血清學(xué)檢測(cè)雞毒支原體和雞滑液囊支原體的抗體。淘汰所有的雞毒支原體和雞滑液囊支原體陽(yáng)性雞。對(duì)可疑的雞群進(jìn)行下一步的病原核酸檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞群應(yīng)維持小群飼養(yǎng)?？梢呻u群病原核酸檢測(cè)采集可疑雞群的咽喉棉拭子樣品進(jìn)行PCR或LAMP，分別檢測(cè)雞毒支原體和雞滑液囊支原體。檢測(cè)雞群處置淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。陰性雞群應(yīng)小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。開(kāi)產(chǎn)前雞群的檢測(cè)和處置雞群臨床觀察觀察開(kāi)產(chǎn)前雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進(jìn)行淘汰?？贵w檢測(cè)同5.1.2.2。可疑雞群病原核酸檢測(cè)同5.1.2.3。檢測(cè)雞群處置淘汰所有血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性和PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞群應(yīng)維持小群飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。留種前的預(yù)防用藥和檢測(cè)以及處置雞群臨床觀察觀察留種雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進(jìn)行淘汰。雞群檢測(cè)在留種前，對(duì)全群100%采血。其余的檢測(cè)按照5.1.2.2和5.2.2.3進(jìn)行。淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞群作為育種雞群。預(yù)防用藥在留種前2周，按照7.2進(jìn)行選擇用藥。種蛋的選留和孵化按照本標(biāo)準(zhǔn)5.1.1～5.1.4規(guī)定程序淘汰所有的陽(yáng)性雞后，每只母雞僅選用1只檢測(cè)為陰性公雞的精液進(jìn)行人工授精。按照育種規(guī)定的時(shí)間留足種蛋，對(duì)每只母雞的種蛋進(jìn)行標(biāo)記。將每只母雞的種蛋置于標(biāo)記有該母雞標(biāo)號(hào)的專(zhuān)用孵化紙袋（紙盒）中，防止不同母雞的種蛋直接接觸，置于孵化器中的特定出雛箱中孵化出雛。種蛋上孵后，在孵化期內(nèi)提升溫度至45℃，維持14h，以消滅種蛋中可能的支原體，然后轉(zhuǎn)入常規(guī)的孵化溫度操作。父母代雛雞的檢測(cè)和處置采集進(jìn)場(chǎng)后的雛雞咽喉棉拭子，處理同5.1.1.2，分別進(jìn)行PCR或LAMP，檢測(cè)雞毒支原體和雞滑液囊支原體。淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。育成期雞群的檢測(cè)和處置同5.1.2。開(kāi)產(chǎn)前雞群的檢測(cè)和處置同5.1.3。留種前的預(yù)防用藥和檢測(cè)以及處置同5.1.4。種蛋的選留和孵化按照本標(biāo)準(zhǔn)5.2.1～5.2.4規(guī)定程序淘汰所有的陽(yáng)性雞后，選用雞毒支原體和雞滑液囊支原體檢測(cè)為陰性公雞的精液進(jìn)行人工授精或自然交配，按照常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)選留種蛋。利用該批種蛋孵化出的雛雞作為雞毒支原體和雞滑液囊支原體凈化后的商品代雞群。凈化周期啟動(dòng)和終止檢測(cè)時(shí)間的選擇曾祖代、祖代可以根據(jù)種雞所處時(shí)期5.1.1～5.1.4的任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)凈化程序。父母代應(yīng)在祖代凈化的基礎(chǔ)上，再在5.2.1～5.2.4的任何一個(gè)環(huán)節(jié)啟動(dòng)凈化程序。不同種雞場(chǎng)可以根據(jù)其具體條件選擇相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)，以提高雞群檢測(cè)的準(zhǔn)確性，縮短凈化周期。凈化標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估凈化效果評(píng)估應(yīng)按照國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)主管部門(mén)制定的雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化評(píng)估程序和凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附錄D。凈化后檢測(cè)比例的調(diào)整按照6.2所列要求判定為種雞達(dá)到雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化狀態(tài)的雞群建議不再按照5.1.1～5.1.4或5.2.1～5.2.4的凈化程序進(jìn)行全部的檢測(cè)，轉(zhuǎn)為按照不低于10%的比例進(jìn)行抽檢，如果抽檢不符合6.2所列要求，則必須按照5.1.1～5.1.4和5.2.1～5.2.4的程序進(jìn)行全部的檢測(cè)，重新進(jìn)行凈化。注意事項(xiàng)生物安全種雞場(chǎng)地理位置應(yīng)相對(duì)隔離，遠(yuǎn)離其他雞場(chǎng)。在引進(jìn)種蛋或雞苗前，應(yīng)先了解種禽場(chǎng)的凈化情況，不能從有疫情的禽場(chǎng)引種。接觸種雞群的工作人員應(yīng)固定化，避免其他雞群的飼養(yǎng)員進(jìn)入實(shí)施凈化的雞群中工作。禽舍在飼養(yǎng)前需經(jīng)過(guò)垃圾清除、高壓水槍沖洗、福爾馬林熏蒸等消毒措施。應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)密度，注意通風(fēng)，保持舍內(nèi)空氣新鮮，防止過(guò)熱過(guò)冷、濕度過(guò)高，定期清糞，防止氨氣、硫化氫等有毒有害氣體的刺激等。運(yùn)送物品車(chē)輛以及人員出入，均應(yīng)執(zhí)行消毒制度，同時(shí)應(yīng)盡可能降低種雞場(chǎng)所需物品與外界的交流。每周進(jìn)行2次～3次帶雞消毒噴霧，出現(xiàn)疫情時(shí)應(yīng)每天進(jìn)行帶雞消毒。應(yīng)堅(jiān)持“全進(jìn)全出”制，最大限度地避免多日齡雞群混養(yǎng)。對(duì)病死雞、未出殼雞胚、雞糞和孵化場(chǎng)內(nèi)廢棄物按NY/T1168和DB63/T1652的要求進(jìn)行無(wú)害化處理。藥物的預(yù)防藥物的使用應(yīng)符合NY/T5030的要求。藥物使用應(yīng)以藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選用高敏藥物。推薦藥物：泰樂(lè)菌素、泰妙菌素、北里霉素、恩諾沙星等，按標(biāo)簽說(shuō)明劑量使用。檔案管理做好種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化工作記錄，并歸檔保存。記錄內(nèi)容包括：平板凝集檢測(cè)抗原購(gòu)進(jìn)和檢測(cè)記錄、LAMP或PCR檢測(cè)記錄、各凈化階段種雞的留種與淘汰記錄等（附錄D）。記錄保存2年。

（資料性附錄）

試劑的配制10mmol/LBetaine溶液Betaine1.1715g滅菌水10mL即配置成1mol/L濃度，取10μL加DEPC水至1mL，制成10mmol/LBetaine溶液。100mmol/LMgSO4MgSO4.7H2O0.246g滅菌水1L

（資料性附錄）

血清平板凝集試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)圖見(jiàn)圖B.1。血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D（左為陽(yáng)性，中為可疑，右為陰性）

（資料性附錄）

LAMP反應(yīng)結(jié)果判定可見(jiàn)光下LAMP反應(yīng)結(jié)果判定可見(jiàn)光下LAMP反應(yīng)陽(yáng)性（綠色熒光）與陰性（橙黃色）對(duì)照?qǐng)D紫外光下LAMP反應(yīng)結(jié)果紫外光下LAMP反應(yīng)陽(yáng)性（綠色熒光）與陰性（無(wú)熒光）對(duì)照?qǐng)D

（資料性附錄）

雞毒支原體病和滑液囊支原體病凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)凈化標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估同時(shí)滿(mǎn)足以下要求，視為達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)：種雞群抽檢，雞毒支原體和滑液囊支原體病原學(xué)檢測(cè)均為陰性；連續(xù)兩年以上無(wú)臨床病例；種雞群抽檢，曾祖代、祖代雞毒支原體和滑液囊支原體血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為0，父母代雞毒