基因工程試題及復(fù)習(xí)資料全集

作業(yè)一：一、名詞解釋：1、基因：是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是 DNA（脫氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。2、基因組該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部 DNA分子3、操縱子:原核生物的幾個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄生成一個 mRNA，然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結(jié)構(gòu)基因與其上游的啟動子，操縱基因共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子。4、啟動子:是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件， 包括至少一個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。 在真核基因中增強(qiáng)子和啟動子常交錯覆蓋或連續(xù)。有時，將結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動子、增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動子。5、增強(qiáng)子:是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在 SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約 200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高 100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占 100～200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為 8～12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。6、基因表達(dá)：是指細(xì)胞在生命過程中，把儲存在 DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。二、簡答題1、說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則 ,即屬名+種名+株名的各一個首字母 ,再加上序號. 基本原則:3-4個字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號; 首字母: 取屬名的第一個字母 ,且斜體大寫;第二字母: 取種名的第一個字母 ,斜體小寫;第三字母:(1)取種名的第二個字母,斜體小寫;(2)若種名有詞頭,且已命名過限制酶,則取詞頭后的第一字母代替.第四字母:若有株名,株名則作為第四字母,是否大小寫,根據(jù)原來的情況而定,但用正體.順序號:若在同一菌株中分離了幾種限制酶,則按先后順序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,等,用正體.2、什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性， 但是這種特異性受特定條件的限制， 即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(>100U／ugDNA)；(3)低離子強(qiáng)度(<25 mmol／L)；1/26高pH(8.0以上)；(5)含有有機(jī)溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價陽離子存在 (如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些？答：（1）DNA的純度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反應(yīng)的溫度 （4）DNA的分子結(jié)構(gòu) （5）核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液4、什么是 Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解 DNA聚合酶I，得到兩個片段，其中大片段的分子量為 75kDa，它具有5'-3' 聚合酶和 3'-5' 外切核酸酶的活性， 小片段具有 5'-3' 外切核酸酶活性。 由于大片段失去了 DNA聚合酶I中會降解 5'引物的5'-3' 外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow 酶主要有下列用途：修復(fù)反應(yīng)，制備平末端可用Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的 5'或3'突出末端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的 DNA片段通過平末端重組。 如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸， 用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備 3'末端標(biāo)記的探針。用Klenow酶修復(fù)5'突出末端的反應(yīng)主要是利用了 Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)3'突出末端則是用Klenow酶的3'-5' 外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用 Klenow酶的切割反應(yīng)來修復(fù) 3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。標(biāo)記DNA3'突出末端(protrudingend)該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用 3'-5' 的外切核酸酶活性除去 3'突出末端，產(chǎn)生 3'隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物(-32p-dNTP) 存在下，使降解 (3'-5') 作用與聚合(5'-3') 作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng) (exchange／replacementreaction) 。不過這一反應(yīng)用 T4DNA聚合酶的效果更好，因它的 3'-5' 外切核酸酶活性較強(qiáng)。(3) 其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行 DNA序列分析、用于 cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法 (primerextension) 制備單鏈DNA探針等。5、細(xì)菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差別是： CIP68°C時失活，而 BAP68°C穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用：(1)dsDNA 的5'端脫磷酸，防止 DNA的自身連接。但是用 CIP處理后，最好將 CIP除去后，再進(jìn)行連接反應(yīng)。(2)DNA 和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。三、論述題1、如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因 ?答：可以通過合成核苷酸探針或設(shè)計簡并 PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選。或者利用相應(yīng)的抗體從 cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)的克隆。作業(yè)二：2/26一、名詞解釋：1、基因工程：在體外將外源基因進(jìn)行切割并與一定的載體連接，構(gòu)成重組 DNA分子并導(dǎo)入相應(yīng)受體細(xì)胞，使外源基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)，使目的基因大量擴(kuò)增或得到相應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物或進(jìn)行定向改造生物性狀。 簡單概括，就是將外源目的基因與載體重組后再進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。2、載體：能載帶微量物質(zhì)共同參與某種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì)，在基因工程重組 DNA技術(shù)中將 DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的 DNA分子。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。3、轉(zhuǎn)化：指將質(zhì)?；蚱渌庠?DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主菌，并使其獲得新的表型的過程。4、感染：利用噬菌體將外源 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。5、轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體將一個細(xì)胞的基因傳遞給另一細(xì)胞的過程。它是細(xì)菌之間傳遞遺傳物質(zhì)的方式之一。其具體含義是指一個細(xì)胞的 DNA或RNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞中。6、轉(zhuǎn)染：指真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源 DNA片段而獲得新的表型的過程。常用的方法有電穿孔法，磷酸鈣共沉淀法，脂質(zhì)體融合法等。二、簡答題1、YAC載體具有什么樣的功能性 DNA序列？為什么在克隆大片段時， YAC具有優(yōu)越性？答：YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個 DNA復(fù)制起點(diǎn)，兩個端粒。 YAC能夠容納長達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。2、列舉質(zhì)粒載體必須具備的 4個基本特性。答：(1) 獨(dú)立復(fù)制； (2) 有選擇標(biāo)記； (3) 有獨(dú)特的酶切位點(diǎn)； (4) 能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散。3、PCR的基本原理是什么？用 PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息？答：)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行 DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。(2) 至少要預(yù)先知道足夠合成一對引物的靶 DNA序列。4、cDNA克隆與基因組克隆有何不同？答：基因組克隆包含所有不在 cDNA中出現(xiàn)的內(nèi)含子。5、怎樣將一個平末端 DNA片段插入到 EcoRI限制位點(diǎn)中去？答：化學(xué)合成一些長為 10bp含有EcoRI識別位點(diǎn)的短的 DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用 EcoRI切割這種連接片段，就會產(chǎn)生 EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何 EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。三、論述題什么是Western印跡？它與 Southern印跡有什么不同答：Western 印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進(jìn)行檢測。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在 Western印跡中使用的探針是抗體 (蛋白質(zhì))。作業(yè)三：3/26一、名詞解釋1、DNA變性：DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。2、DNA復(fù)性：變性 DNA在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象 ,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。3、退火：指模板雙鏈DNA經(jīng)熱變性，螺旋解開成單鏈后，通過緩慢冷卻到55℃左右，使引物(即具有互補(bǔ)堿基的RNA片段)與該模板DNA單鏈重新配對，形成新的雙鏈分子的過程。4、DNA芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的 DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。5、錯義突變：堿基替換的結(jié)果引起氨基酸順序的變化。6、基因診斷：又稱 DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對疾病做出判斷。二、簡答題1、什么是藍(lán)白斑篩選法？答：這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體。主要是在載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的載體轉(zhuǎn)入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解X-gal的能力，轉(zhuǎn)入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。2、什么是基因文庫？用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上,然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系（克?。谥苽涞目寺?shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。3、黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也有一些不足，請指出這些不足之處。答：黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克?。?3)難插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。4、什么是同聚物加尾連接法？用何種方法加尾？具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？答：所謂同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的3'-OH上。2+3'-OH端逐個添加單核苷酸，如果用2+以Mg作為輔助因子，該酶可以在突出的Co作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的3'-OH端逐個添加單個核苷酸。同聚物加尾法實(shí)際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點(diǎn)：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。(2)因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。(3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進(jìn)行連接。同聚物加尾法也有一些不便之處：(1)方法繁瑣；外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達(dá)。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)。5、何謂接頭連接法？答：將人工合成的或來源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段 DNA分子(在這一小段 DNA分子上有某種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列 )，加到載體或外源 DNA的分子上，這樣便在載體 DNA和外源DNA上制造出新的酶切點(diǎn)。把這一小段含有酶切點(diǎn)的 DNA分子稱為連接器分子，這種方法稱為接頭連接法。三、論述題1、什么是基因組文庫 (genomiclibrary)? 構(gòu)建基因組文庫，涉及哪些基本過程 ?它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同 ?答：基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組 DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程： (1)高分子量染色體 DNA的制備；(2)體外重組連接； (3)包裝蛋白的制4/26備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導(dǎo)人寄主細(xì)胞；(6)篩選。基因組文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念。基因庫(genepool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。作業(yè)四：一、名詞解釋1、DNA重組：是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。2、克?。嚎茖W(xué)家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù)，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞系，該細(xì)胞系中每個細(xì)胞的基因彼此相同。3、DNA克?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)——同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。4、目的基因：把需要研究的基因稱為目的基因。（一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因，有時三者含義相近。）5、基因載體：基因載體是把基因?qū)爰?xì)胞的工具，他的作用是①運(yùn)載目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，②使之能得到復(fù)制和進(jìn)行表達(dá)。6、質(zhì)粒：質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌擬核裸露DNA外的遺傳物質(zhì)，為雙股閉合環(huán)形的DNA,存在于細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒編碼非細(xì)菌生命所必須的某些生物學(xué)性狀，如性菌毛、細(xì)菌素、毒素和耐藥性等。質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。二、簡答題 1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？答：限制性內(nèi)切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA連接酶,堿性磷酸酶,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶.限制性內(nèi)切核酸酶,能夠識別特異的DNA堿基序列，DNA堿基序列往往呈回文對稱結(jié)構(gòu)；DNA聚合酶a位于細(xì)胞核內(nèi)，也許是復(fù)合物，有催化細(xì)胞增生的作用；Klenow大片段它也可以通過基因工程得到，分子量為76kDa。DNA連接酶負(fù)責(zé)雙鏈DNA中相鄰3`-OH與5`-磷酸基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵的形成。堿性磷酸酯酶的作用是從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘基。末端轉(zhuǎn)移酶的作用是將脫氧核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵加到DNA分子的3`-OH末端。2、重組DNA技術(shù)常包括哪些基本步驟？答：①獲得目的基因；②與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；③用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；④對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定。在具體工作中選擇哪條技術(shù)路線；⑤對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。主要取決于基因的來源、基因本身的性質(zhì)和該項(xiàng)遺傳工程的目的。3、常用的目的基因的獲取方法有哪些？答： 直接獲取從基因文庫中提取目的基因，使用 PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得目的基因 ; 人工合成.4、常用的目的基因與載體的連接方法有哪些？答：外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于核酸內(nèi)切限制酶和DNA連接酶的作用．一般說來在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)程序時，需要考慮到下列三個因素：（1）實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能地簡單易行；（2）連接形成的"接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。5、解釋質(zhì)粒，為什么質(zhì)?？勺鳛榛蜉d體。答：質(zhì)粒是細(xì)菌擬核裸露DNA外的遺傳物質(zhì)。質(zhì)粒：（1）具有較小的分子量。經(jīng)驗(yàn)表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR322質(zhì)粒這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。三、論述題1、何謂限制性核酸內(nèi)切酶？寫出大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶識DNA序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。答：限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異性核苷酸序列并由此特異切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的水解酶.是在DNA分子內(nèi)部切割，水解磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。能夠識別特異的DNA堿基序列，DNA堿基序列往往呈回文對稱結(jié)構(gòu)；并具有特異切割位點(diǎn)。作業(yè)五：5/26一、名詞解釋1、限制性核酸內(nèi)切酶：是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并在識別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。2、基因文庫：將所有的重組DNA分子都導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體稱為基因文庫。3、cDNA文庫：從組織細(xì)胞中分離得到純化的mRNA，然后以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ)DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后導(dǎo)入受體菌內(nèi)，擴(kuò)增，構(gòu)建cDNA文庫。4、RFLP：RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。5、核酸探針：是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。6、轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄是遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)換到RNA的過程。作為蛋白質(zhì)生物合成的第一步，轉(zhuǎn)錄是mRNA以及非編碼RNA（tRNA、rRNA等）的合成步驟。二、簡答題：1、試回答影響限制性內(nèi)切核酸酶切割效率的因素？答：外因：是可以預(yù)見的，如反應(yīng)條件（緩沖液、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、終止酶切的方法）、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積等等;內(nèi)因：星星活性、末端長度、位點(diǎn)偏愛、甲基化底物、底物的構(gòu)象。2、何為載體？一個理想的載體應(yīng)具備那些特點(diǎn)？答：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（hostcell）的工具稱為載體載體具備的特點(diǎn)：①在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）②必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時不影響其復(fù)制③有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選④最好具有較高的拷貝數(shù)，便于制備。3、什么叫基因工程（GeneEngineering），試從理論和技術(shù)兩個方面談?wù)凣eneEngineering誕生的基礎(chǔ)？答：基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原來沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。理論基礎(chǔ)：近幾十年來，由于受到分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)展的影響，基因分子生物學(xué)的研究取得了前所未有的進(jìn)步。而這些學(xué)科的綜合成就，又為基因工程的誕生奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)：①在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；②在50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題；③在50年代末期和60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。技術(shù)基礎(chǔ)：①60年代-70年代，限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶解決了對DNA分子進(jìn)行體外的切割和連接；②基因克隆載體的出現(xiàn)③大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立④60年代發(fā)展的瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)對DNA片段的分離和檢測十分有用。4、抗性基因是目前使用的最廣泛的選擇標(biāo)記，常用的抗生素抗性有哪幾種？并舉兩例說明其原理？答：氨芐青霉素抗性基因ampr、四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr①氨芐青霉素抗性基因ampr:青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng).氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化b-內(nèi)酰胺環(huán)水解（水解青霉素），從而解除了氨芐青霉素的毒性。②四環(huán)素抗性基因tetr：四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。5、YAC載體具有什么樣的功能性元件？為什么它在克隆大片段時具有很大的優(yōu)越性？答：YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括自主復(fù)制序列ARS，一個著絲粒，兩個端粒，選擇標(biāo)記，篩選模型。優(yōu)越性：YAC能夠容納長達(dá)幾百Kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和粘粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。YAC有靈活性，可作為質(zhì)粒在E.coil中增殖；與大片段連接時，可導(dǎo)入酵母，作為真正染色體在酵母復(fù)制中有絲分裂。三、論述題1、分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點(diǎn)？答：同：①原理相同。瓊脂糖、聚丙烯酰胺均為無反應(yīng)活性的穩(wěn)定支持介質(zhì)，可降低對流運(yùn)動，故使電場中的分子電泳遷移率僅與分子的摩擦系數(shù)成反比。在一定電場強(qiáng)度下， DNA分子的遷移率取決于核酸分子的大小和構(gòu)象。 ②凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙大?。粷舛仍礁?，空隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度降低，空隙就增大，6/26其分辨能力也就隨之減弱。異：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為02.Kb-50Kb之間；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范圍為1-1000bp，分離小片段效果最好，分辨率極高，相差1bp的DNA也可分開。分子克隆技術(shù):指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)克隆：是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上相同的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體載體：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具?；瘜W(xué)本質(zhì)：DNA1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件?；蚬こ痰暮x：按照預(yù)先設(shè)計好的藍(lán)圖，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，特別是酶學(xué)技術(shù)，對一種生物（供體）的遺傳物質(zhì)（DNA）直接進(jìn)行體外重組操作與改造，并轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體）中去，從而實(shí)現(xiàn)受體生物的定向改造與改良。黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來DNA連桿，是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。DNA接頭它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具黏性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。載體：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并為其提供復(fù)制和功能基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的工具。目的基因：基因工程中克隆的目標(biāo)DNA分子SD序列：mRNA中起始密碼子上游8-13個核苷酸處有一段富含嘌呤核苷酸的順序，它可以與30S亞基中的16SrRNA3’端富含嘧啶的尾部互補(bǔ)，形成氫鍵結(jié)合，有助于mRNA的翻譯從起始密碼子處開始啟動子：DNA分子與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也是轉(zhuǎn)錄開始的部位基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為該生物的基因組文庫。cDNA：以mRNA為模板合成的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列。cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為cDNA文庫。轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。感受態(tài)：指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片斷并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)染：將重組λDNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程重組子的篩選：經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體，獲得所需目的重組子的過程選擇：轉(zhuǎn)化子的初步篩選：通過某種外加壓力（如：抗生素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆子的一種方法。篩選：進(jìn)一步檢測目的重組子：通過某種特定的方法，從受體細(xì)胞群體或基因文庫中，鑒定出目的重組子的過程。啟動子：DNA鏈上一段能與 RNA聚合酶結(jié)合并能起始 mRNA合成的序列SD序列：核糖體結(jié)合位點(diǎn)終止子：在一個基因的 3’端或是一個操縱子的 3’端往往還有一特定的核苷酸序列， 它有終止轉(zhuǎn)錄的功能， 這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的 N末端由原核 DNA序列或其他 DNA序列編碼，C端由真核 DNA的完整序列編碼 。轉(zhuǎn)染：將重組λDNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源 DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程重組子：含有重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源 DNA分子后穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞供體、受體、載體是 DNA重組技術(shù)的三大基本元件7/26DNA體外重組的基本步驟1.目的基因的獲取：從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E：1.目的基因的獲取從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達(dá)使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物載體應(yīng)具備的條件：1.具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點(diǎn)5.具有合適的選擇性標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶的命名原則前3個字母代表來源的生物,隨后1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株,最后1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序staractivity高濃度的酶（>100U/g）、高濃度的甘油（>5%）、低離子強(qiáng)度（<25mM）、極端pH值(>pH8.0)等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的staractivity現(xiàn)象.抑制staractivity的措施①減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度②保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶濟(jì)或乙醇③提高離子強(qiáng)度到100～150mM④降低反應(yīng)pH至pH7.0⑤使用Mg2+作為二價陽離子DNA連接酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基(-OH)，和在另一條DNA鏈的5’-末端具有一個磷酸基團(tuán)(-P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用。體外連接DNA片段的方式黏性末端同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端的連接，同尾酶產(chǎn)生的黏性末端的連接，不同黏性末端的連接。平末端的直接連接，末端修飾后的連接，加上連桿（linker），使之形成黏性末端后，再用DNA連接酶連接，DNA接頭(adapter)連接法。平末端DNA片段的連接（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接；（3）用連桿連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。載體應(yīng)具備的條件1.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.具有多種單一的酶切位點(diǎn)4.具有合適的選擇性標(biāo)記自我復(fù)制表達(dá)，外源基因的插入不影響其功能的發(fā)揮，易于從宿主細(xì)胞分離出來5.分子量盡可能小，以提高其載裝能力質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒天然質(zhì)粒的缺陷（1）分子量大，拷貝數(shù)低（2）篩選標(biāo)志不理想構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略1能在受體中進(jìn)行有效的復(fù)制（有復(fù)制起始位點(diǎn)）。2含多克隆位點(diǎn)3含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因，如：常用的標(biāo)記基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4DNA分子盡可能小和較高的拷貝數(shù)。5根據(jù)特殊需要，組裝各種“元件”，構(gòu)建不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建1選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒2正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件3組裝合適的選擇標(biāo)記基因4選用合適的啟動子5構(gòu)建過程力求簡單DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱之為插入失活效應(yīng)。藍(lán)白斑篩選Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過程①根癌農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的識別和附著②根癌農(nóng)桿菌對植物信號物質(zhì)的感受③根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化④vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內(nèi)切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝，T-DNA復(fù)合體的產(chǎn)生⑤T-DNA復(fù)合體在RB序列的引導(dǎo)下定向地穿過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、進(jìn)入植物細(xì)胞壁并整合到植物的染色體基因組中TA克隆的優(yōu)點(diǎn)不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR產(chǎn)物做平端處理，不需在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。TA克隆注意事項(xiàng)1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過純化。3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來DNA污染。真核生物的啟動子：真核生物有三種類型的RNA聚合酶，每一種都有對應(yīng)的啟動子。1.RNA聚合酶I只轉(zhuǎn)錄rRNA，故只有一種啟動子。8/262.RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA，其啟動子最為復(fù)雜；3.RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和5SrRNA，其啟動子大都是位于轉(zhuǎn)錄的 DNA序列之內(nèi)，稱為下游啟動子。目的基因的獲得 :直接分離法;PCR擴(kuò)增;構(gòu)建基因組文庫法 ;構(gòu)建cDNA文庫法;化學(xué)合成法直接分離法: 限制酶酶切法 (DNA分子已測序/目的基因已定位 )基因組文庫的構(gòu)建 (DNA未測序或未定位 )：采用限制酶切割構(gòu)建基因組文庫篩選目的基因克隆基因文庫構(gòu)建的一般步驟：1）染色體DNA大片段的制備①酶切法②物理切割法2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接②人工接頭法3）轉(zhuǎn)導(dǎo)受體4）篩選重組子cDNA：以mRNA為模板合成的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列。cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部 mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種 cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為 cDNA文庫。cDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別在于 cDNA文庫是有時效性的。cDNA文庫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分離的目的基因可直接用于表達(dá)；比 DNA文庫小的多，容易構(gòu)建缺點(diǎn)：只與編碼序列有關(guān)；不能反映內(nèi)含子；不能反映啟動子、終止子以及與核糖體識別的序列構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟：1）總RNA（totalRNA）提取2）mRNA的分離純化①原理：利用mRNA都含有一段 polyA尾巴，將 mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA的分離純化Column（柱）3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成②降解mRNA模板③cDNA第二鏈合成（cDNA第二鏈合成的方法有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物－銜接頭合成法。）4）cDNA與載體連接：5）噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入宿主中繁殖）基因的化學(xué)合成：寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成；探針的化學(xué)合成；連接子和接頭的合成；基因的半合成；全長基因化學(xué)合成目的基因的分離：目的序列已知： 一般采用 PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達(dá)序列；無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法基因克隆的方法：一、目的基因的功能克隆二、 序列克隆法三、差別雜交法四、減法雜交技術(shù)9/26五、mRNA差別顯示技術(shù)功能克?。焊鶕?jù)已知基因的產(chǎn)物推斷出其相應(yīng)核苷酸序列，再根據(jù)此序列合成寡核苷酸探針，從 cDNA 文庫或基因組文庫中調(diào)取目的基因表型克?。喝绮町惡Y選法、差減雜交（ SH）、mRNA差別顯示技術(shù)（ DDRT-PCR）、代表性差異分析（ RAD）、抑制型差減雜交（SSH）等無基因序列及表達(dá)功能信息，但具有基因遺傳圖，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等條件，常用圖位克隆和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆目的基因的功能克?。?在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建 cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因1、根據(jù)特異蛋白分離目的基因分離、純化目的蛋白測定特異的氨基酸順序推測編碼該蛋白的核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因分離、純化目的蛋白目的蛋白免疫動物，制備抗體從cDNA表達(dá)文庫中篩選目的基因根據(jù)特異蛋白分離目的基因局限性：特異蛋白已鑒定并分離純化某些基因產(chǎn)物，難以分離純化非所有基因有蛋白質(zhì)產(chǎn)物遺傳密碼的簡并性2、功能互補(bǔ)法克隆基因： 利用被克隆的外源片段與宿主細(xì)胞染色體 DNA具有功能互補(bǔ)。篩選營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因序列克隆法：根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因；采用核酸探針雜交篩選或用 PCR技術(shù)進(jìn)行分離差別雜交法： 組織特異性表達(dá)或特定發(fā)育階段表達(dá)的基因；受生長因子調(diào)節(jié)的基因；經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中的差異性表達(dá) （一個細(xì)胞群體中正常表達(dá)， 另一個細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)）?；具^程：制備兩種細(xì)胞群體的的 mRNA提取物；以兩種總 mRNA或cDNA為探針；以表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建cDNA文庫局限性：靈敏度比較低，不適于低豐度 mRNA目的基因分離需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑差別雜交重復(fù)性較差不同濾膜間 DNA保有量不均一雜交信號強(qiáng)度不一致重新點(diǎn)雜交減法雜交技術(shù)： 又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交本質(zhì)：盡量去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性mRNA減法雜交；基因組減法雜交感受態(tài)細(xì)胞的制備：1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于 2mLLB液體培養(yǎng)基中， 37℃振蕩培養(yǎng)過夜2、按1％的接種量接種于 3mL新鮮LB培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.4-0.6(可見霧狀)3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000rpm離心1min，倒出培養(yǎng)液，用無菌濾紙盡量吸干4、加入1mL預(yù)冷的無菌 0.1mol·L-1CaCl2溶液渦旋，4℃下12,000rpm離心30秒,盡量去除上清5、沉淀以 50-100μL預(yù)冷的0.1molL·-1CaCl2重懸，4℃保存?zhèn)溆茫?7d內(nèi)可用。10/26大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：1.Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法CaCl2 的誘導(dǎo)原因： 在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹， Ca2＋使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)Ca2＋能與加入的 DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面； 42℃熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間隙。對照試驗(yàn)：轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性2.電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，促進(jìn)外源 DNA的有效吸收。影響因素：電場強(qiáng)度，電脈沖時間，外源 DNA濃度3.三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法作用機(jī)制：將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入農(nóng)桿菌中的 Ti質(zhì)粒載體；農(nóng)桿菌識別敏感植物，將 Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)部基本程序：選擇合適的外植體；農(nóng)桿菌的接種操作；洗菌并篩選培養(yǎng)常用方法：1.創(chuàng)傷植株感染法2.共培養(yǎng)感染法 ：葉盤轉(zhuǎn)化法；植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法 ；植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法 ；原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法2）DNA的直接轉(zhuǎn)移法：多聚物介導(dǎo)法；電穿孔轉(zhuǎn)化法；激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法；顯微注射法；超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法；基因槍法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法；花粉管通道法重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 ：病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法生化轉(zhuǎn)染：磷酸鈣轉(zhuǎn)染法； DEAE－葡聚糖轉(zhuǎn)染法；聚陽離子－ DMSO轉(zhuǎn)染法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法物理轉(zhuǎn)染：顯微注射法；電穿孔法常見的篩選重組子方法1遺傳表型直接篩選： 抗藥性篩選；插入失活篩選法；插入表達(dá)篩選法；顯色互補(bǔ)篩選法2PCR法鑒定酶切法鑒定雜交法鑒定：Southernblot；Northernblot；Westernblot等測序原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)①只有一種 RNA聚合酶識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有 RNA的合成。②基因的表達(dá)是以操縱子為單位的。③原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。④原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個 S-D序列，而真核基因則缺乏此序列 。啟動子的特性： 列特異性；向性；置特異性；屬特異性幾種類型的原核表達(dá)載體非融合蛋白 ：不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白優(yōu)點(diǎn)：它具有非常接近于真核細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：易被細(xì)菌蛋白酶破壞。融合蛋白：由一條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。優(yōu)點(diǎn)：大大增加，不易被細(xì)菌蛋白酶降解；于分離純化11/26影響基因表達(dá)效率的因素： 啟動子的強(qiáng)度、 DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、 mRNA分子的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞的生理特征等提高基因表達(dá)效率的途徑：1.采用強(qiáng)啟動子； 35和-10區(qū)之間保持的距離（ 16～19bp）2.確定合適的 SD序列后面的幾個堿基成分及起始密碼子上游的堿基成分3.起始密碼子和 S-D序列之間的距離必須接近到一定程度（ 7個核苷酸時最合適）4.在基因內(nèi)部的適當(dāng)位置上存在著轉(zhuǎn)錄的終止區(qū)，就能夠保證使質(zhì)粒的拷貝數(shù) (也就是基因的表達(dá)效率 )控制在一個正常的水平上。5.提高基因的拷貝數(shù)（將基因克隆到松弛型的質(zhì)粒載體上）6.輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷：（1）誘導(dǎo)表達(dá)：細(xì)菌的生長與外源基因的表達(dá)分開，是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷的最為常用的一個方法表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制：將宿主菌的生長和質(zhì)粒的復(fù)制分開7.高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白采用某種突變菌株，保護(hù)表達(dá)蛋白不被降解表達(dá)分泌蛋白基因工程的應(yīng)用：醫(yī)藥業(yè)：疾病的預(yù)防;病的診斷;病的治療農(nóng)業(yè)及食品工業(yè):提高作物抗性;良作物品質(zhì);長果實(shí)貨架期;用農(nóng)作物生產(chǎn)藥物畜牧業(yè);工食品環(huán)境:環(huán)境檢測;環(huán)境凈化第一章 基因工程的概念第一節(jié) 基因工程誕生的理論基礎(chǔ).確定了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)。明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1944 年Avery，確定了基因的分子載體是 DNA，而不是蛋白質(zhì)。噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1952 年AlfredHershy 和MarshaChase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是 DNA二.揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題。1953 年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick 揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。.提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題1958年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等終于破譯了64個遺傳密碼F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操縱子學(xué)說第二節(jié) 基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ)DNA分子的體外切割與連接1.限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes ）WernerArber 理論預(yù)見限制酶1968 年H.O.Smith 等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶DanielNathans 用限制酶切得 SV40DNA片斷12/26人于1978年獲得Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎2.DNA連接酶（ligase）1967年5個實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶二.DNA分子的核苷酸序列分析1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術(shù),1980年Nobel化學(xué)獎三.載體的構(gòu)建1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和 噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增四.轉(zhuǎn)化技術(shù)1970年M.Mandel和A.Higa 發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體 DNA。1972年S.Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒 DNA五.瓊脂糖凝膠電泳和 southern轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)1960s 發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的 DNA分離開;DNA印跡技術(shù)由 Southern于1975創(chuàng)建,稱為Southern 印跡技術(shù).基因工程的定義和特征1.定義在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建遺傳物質(zhì)的新組合，并使之滲入到原先沒有這類分子的寄生細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體 DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物第二章 酶學(xué)基礎(chǔ)1拷貝數(shù)就是指某目的基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物群體或個體中存在的個數(shù) . 單拷貝就是該基因在基因組中只有一個 ,多則指有多個。(一)在細(xì)菌細(xì)胞中，某種特定質(zhì)粒的數(shù)目。根據(jù)復(fù)制特性，質(zhì)粒分嚴(yán)緊型和松弛型兩類，前者在細(xì)胞中只含1～2個，而后者含 10～15個以上。恒定的 拷貝數(shù)與質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)、宿主細(xì)胞遺傳背景及生長條件有關(guān)。質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)首先通過調(diào)節(jié)復(fù)制的起始點(diǎn)來控制拷貝數(shù)，調(diào)節(jié)因素包括阻遏蛋白、反義 RNA和某些順向重復(fù)序列。有些質(zhì)粒還有其他控制系統(tǒng)，如有分配功能的 par系統(tǒng)和確保質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的 ccd系統(tǒng)。一旦質(zhì)粒上與調(diào)控有關(guān)的基因或位點(diǎn)突變，可使拷貝數(shù)明顯增加或減少。(二)。工具酶：進(jìn)行DNA操作經(jīng)常要用到的“工具”——酶四大工具酶：核酸酶nucleases 連接酶ligase 聚合酶polymerase修飾酶modificationenzyme第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶 【命名、識別位點(diǎn)、切割過程、末端特征（粘端、平端） 、酶活單位及定義】限制性內(nèi)切酶：指能識別特定的DNA序列，在一定的條件下，可在識別位置上或附近對DNA進(jìn)行切割的酶。.限制性內(nèi)切酶的命名與種類按照國際命名法，限制性內(nèi)切核酸酶屬于水解酶類。由于限制性酶的數(shù)量眾多，而且越來越多，并且在同一種菌中發(fā)現(xiàn)幾種酶。為了避免混淆， 1973年Smith 和Nathans對內(nèi)切酶的命名提出建議， 1980年，Roberts 對限制性酶的命名進(jìn)行分類和系統(tǒng)化。限制性酶采用三字母的 命名原則，即屬名 + 種名+ 株名的個一個首字母，再加上序號，A、第一個字母大寫，表示該酶來源的細(xì)菌屬名的第一個字母B、第二、三個字母小寫，表示該酶來源的細(xì)菌的種名的前 2個字母13/26C、第四個字母大寫代表不同的變種/品系小寫代表不同的菌株和型D、最后羅馬字母，代表同一菌株中不同的限制性內(nèi)切酶注意限制性內(nèi)切酶的正確寫法：1、前3個字母一定斜體2、字母與羅馬數(shù)字間空格如：RIPstIEco類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ類酶不僅是一種核酸內(nèi)切酶,同時在酶分子上還具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多種酶活性的復(fù)合酶類。作用時除了需要2+Mg作輔助因子外,還要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ類酶具有特異的識別序列，大約15個堿基對。Ⅰ類酶雖然能夠在一定序列上識別DNA分子,并能同DNA分子作用,因其識別DNA后,要朝一個方向或兩個方向移動一段距離(通常為1000個堿基左右)，并且要形成一個環(huán)才能切割DNA(圖),所以識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，產(chǎn)生的片段較大。類限制性內(nèi)切核酸酶III 類限制性內(nèi)切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亞基組成類似于Ⅰ類酶 , 作用方式基本同Ⅱ類酶。如EcoP1是由兩個亞基組成， 一個亞基(M亞基)負(fù)責(zé)位點(diǎn)識別和修飾。 另一個亞基(R亞基)具有核酸酶的活性 (圖3-5)。切割DNA時需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶這類酶的分子量較小 . 一般在2-4萬道爾頓, 通常由2-4個相同的亞基所組成。 它們的作用底物為雙鏈 DNA,極少數(shù)Ⅱ類酶也可作用于單鏈 DNA,或DNA/RNA雜種雙鏈。這類酶的專一性強(qiáng) , 它不僅對酶切點(diǎn)鄰近的兩個堿基有嚴(yán)格要求, 而且對更遠(yuǎn)的堿基也有要求 , 因此, Ⅱ類酶既具有切割位點(diǎn)的專一性 , 也具有識別位點(diǎn)的專一性 , 一般在識別序列內(nèi)切割。切割的方式有平切和交錯切 , 產(chǎn)生平末端的 DNA片段或具有突出粘性末端的 DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用時需要 Mg2+作輔助因子, 但不需要 ATP和SAM。Ⅱ類酶與對應(yīng)的甲基化酶在蛋白亞基上尚未發(fā)現(xiàn)有什么關(guān)系, 第一個被分離的Ⅱ類酶是 HindⅡ。a.識別位點(diǎn)：絕大多數(shù)的 II 型核酸內(nèi)切限制酶， 都能夠識別由 4～8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。 我們稱這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識別序列。 而II 型限制酶就是從其識別序列內(nèi)切割 DNA分子的，因此識別序列又稱為核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或靶序列。有些識別序列是連續(xù)的 (如GATC)，有些識別序列則是間斷的 (如GANTC)，N是代表任意一種核苷酸堿基切割位點(diǎn)的一個共同特點(diǎn)是，它們具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)形式，換言之，這些核苷酸對的順序是呈回文結(jié)構(gòu)。這段序列有兩個基本的特征，第一是能夠在中間劃一個對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補(bǔ)配對，第二個特點(diǎn)是兩條互補(bǔ)鏈的 5’到3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn) 1800，則兩條鏈重疊。b. 切割類型檢驗(yàn)了非常大量的實(shí)驗(yàn)事例之后發(fā)現(xiàn)，由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的 DNA分子的切割類型，通常是屬于下述兩種獨(dú)特的排列方式之一：（1）兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具 有粘性末端的DNA片段；（2）兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心，這樣形式的斷裂是形成具有 平末端的DNA片段。c.產(chǎn)生的末端特征：Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的切割產(chǎn)物有 平末端和粘性末端(cohesiveend) 。粘性末端是指 DNA分子的兩端具有彼此互補(bǔ)的一段突出的單鏈部分 , 這一小段單鏈部分和同一分子的另一端或其它分子末端的單鏈部分如果互補(bǔ)的話，則能通過互補(bǔ)堿基之間的配對,形成雙鏈。并在DNA連接酶的作用下,使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀,或使兩個分子連成一大的線狀分子。已知有兩種不同類型的限制酶都可以產(chǎn)生粘性末端，但一種是形成具有 3’粘性末端，例如 PstI 酶就是屬于這種類型；另一種則是形成具有 5’粘性末端，例如 EcoRI酶便是此種類型的一個代表。14/26粘性末端能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來，平末端的 DNA片段則不易于重新環(huán)化。酶活性單位：1單位限制性內(nèi)切酶（1U）通常定義：在建議使用的Buffer及溫度下，在20l（50l）反應(yīng)體系中反應(yīng)1小時，使1g入DNA完全消化所需的酶量.星活性（starctivity ）在非最適的反應(yīng)條件下，酶的識別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種酶切特異性降低的現(xiàn)象，稱為星活性。所謂非最適的反應(yīng)條件：過量酶、低鹽濃度、過量甘油、高pH（8.0以上）、有機(jī)溶劑ex：酒精（EcoRI對酒精敏感）、SDS、苯酚、氯仿等。.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素、DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等將影響DNA樣品的純度。如果DNA樣品難以純化時，可以采取下列方法進(jìn)行酶切：加大酶的用量， 1mgDNA用10U酶(但是不能超總體積 1/10加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間、DNA樣品的甲基化程度：核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強(qiáng)烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒 DNA?？梢岳貌煌南拗菩詢?nèi)切酶對甲基化敏感程度不同，研究不同條件下 DNA的甲基化程度。3、緩沖液性質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、 Tris- HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇 (DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是 Mg2+。不正確的 NaCl或Mg2+濃度，不僅會降低限制酶的活性，而且還可能導(dǎo)致識別序列特異性的改變。緩沖液Tris—HCl的作用在于使反應(yīng)混合物的 pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。 對絕大多數(shù)限制酶來說，在 pH=7．4的條件下，其功能最佳。巰基試劑對于保持某些核酸內(nèi)切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護(hù)其免于失活。但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。有一部分核酸內(nèi)切限制酶對于鈉離子或鉀離子濃度變化反應(yīng)十分敏感，而另一部分核酸內(nèi)切限制酶則可適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度。4、酶切反應(yīng)的溫度DNA酶切反應(yīng)的溫度，是影響核酸內(nèi)切限制酶活性的另一個重要因素。不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是 37℃。但也有許多例外的情況，它們要求37℃以外的其它反應(yīng)溫度。其中有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃。有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)的 37℃，例如 MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII 是55℃；還有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度可高達(dá) 60℃以上。消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內(nèi)切限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。酶切的方式：15/261、完全酶切： 內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點(diǎn)都被切開。2、不完全酶切： 只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開，可以通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。第二節(jié) 連接酶（ligase)連接酶的作用機(jī)理與反應(yīng)條件：1、作用機(jī)理：1）ATP（NAD+)提供激活的AMP2）ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3）AMP與連接酶的賴氨酸e-氨基相連。4）AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。（5）3’-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出 AMP。2、反應(yīng)條件1）必須是兩條雙鏈DNA，如果為粘性末端，末端必須配對。2）DNA的3’端有游離的-OH’，5’端有一個磷酸基團(tuán)（P）。3）需要能量：動物或噬菌體中： ATP大腸桿菌中： NAD+連接酶的種類： T4-DNA連接酶、E.coliDNA 連接酶、T4-RNA連接酶、連接酶的活性單位與定義 ：一般采用 Weiss 單位來衡量 T4DNA連接酶的活性。在 37℃下20 分鐘催化 1nmol32p從焦磷酸根置換到[γ，β,32P]ATP 所需的酶量，定義為1 個Weiss 單位。該定義方法基于 ATP和焦磷酸的交換， 是最常用的連接酶單位，但該定義所展示的直觀生物學(xué)意義不顯著。 NewEnglandBiolabs 公司也提出了一種 定義方式，通過粘性末端的連接效率來表示。即，在 20μl 反應(yīng)體系中于 16℃，使HindⅢ切過的 DNA（300μg/ml，0.12μM5'末端）在 30 分鐘內(nèi)連接 50%所需的酶量為 1 個NEB單位。1NEB 單位等于0.015Weiss 單位，1Weiss 單位等于67NEB單位。影響連接酶效果的因素1、酶切片段的狀態(tài)：粘性末端連接效率比平端至少大 100倍5’突出粘性末端大于 3’突出粘性末端不同的限制性內(nèi)切酶片段連接效率不同，以 HindIII 最好。2、插入片段與載體的濃度比例：ＤＮＡ一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內(nèi)連接）還是位于不同分子（分子間連接） ，都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ， 也就是用可產(chǎn)生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。如果反應(yīng)中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端為同一ＤＮＡ分子的機(jī)會較大（因?yàn)椋模危练肿拥囊粋€末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率） 。因此，在ＤＮＡ濃度低時，質(zhì)粒ＤＮＡ重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反應(yīng)的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。進(jìn)行克隆時， Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為 1：2～10，增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。3、反應(yīng)溫度：37℃連接酶活性最高，但 37℃時粘性末端 DNA分子形成的配對極不穩(wěn)定，故最佳 12-16℃，最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又要有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。4、反應(yīng)液中的成分（特別針對平端連接） ：16/26由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下４個條件：１）低濃度（0.5mmol/L）的ATP ２）不存在亞精胺一類的多胺３）極高濃度的連接酶（ 50Weiss單位．ml） ４）高濃度的平端。凝聚劑：反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇或氯化六氨全高鈷 ,可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個數(shù)量級，因此可使連接反應(yīng)在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進(jìn)行。２）它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。第三節(jié)DNA聚合酶（原理、用途）聚合酶的種類：1、依賴DNA的DNA聚合酶：大腸桿菌 DNA聚合酶、Klenowfragment、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶和修飾過的T7DNA聚合酶、不依賴DNA的DNA聚合酶：末端轉(zhuǎn)移酶、依賴RNA的DNA聚合酶：反轉(zhuǎn)錄酶4、依賴DNA的RNA聚合酶：E.coliRNA 聚合酶，phageSP6、T7和T3RNA聚合酶5、不依賴 DNA的RNA聚合酶：polyA聚合酶DNA聚合酶1、DNA聚合酶I：聚合酶活性：5’》 3’，需要引物外切酶：5’》 3’3 ’》 5’校正功能應(yīng)用：缺平移探針標(biāo)記2、Klenowfragment ：聚合酶活性：5’》 3’，需要引物外切酶：3’ 》5’用途：A：末端標(biāo)記法 B ：合成cDNA的第二鏈C：隨機(jī)引物（ 6nt）標(biāo)記 D ：末端終止法進(jìn)行 DNA序列分析3、T4-DNA聚合酶 ：聚合酶活性：5’ 3’，外切酶：3’ 5’外切酶活性較 klenow片段的活性大 200倍，對單鏈 DNA的活性大于雙鏈 DNA。特點(diǎn)：當(dāng)沒有 dNTP時，T4DNA聚合酶行使 3’ 5’外切酶功能，制造出 3’隱蔽端。如果只有一種 dNTP，則降解到該dNTP的位置。用途：A、填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切割 DNA后產(chǎn)生的凹缺 3’B、末端標(biāo)記帶 3’突出末端的 DNA：利用3’ 5’外切酶活性作用于所有末端形式的 3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出 3’隱蔽端，再利用它的5’ 3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的 dNTPC、標(biāo)記用作雜交探針的 DNA片段D、將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平E：體外誘變4、T7-DNA聚合酶:從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個亞基組成：（1）T7基因5編碼的大亞基：有 5’ 3’聚合酶和 3’ 5’外切酶活性。17/26（2）大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，增加大亞基對模板的親和性T7-DNA聚合酶的用途：A、用填補(bǔ)或交換（取代）反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記；B、將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平末端；C、復(fù)制較長的模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在測序中讀出較長的序列。5、修飾的 T7DNA聚合酶通過修飾使 3’ 5’外切酶活性下降 99%以上，但聚合能力不受影響，修飾后的 T7DNA聚合酶在聚合反應(yīng)中有很高的持續(xù)性；進(jìn)一步改進(jìn)的基因工程生產(chǎn)的測序酶 2.0，完全沒有核酸外切酶花性。用途：1）DNA序列分析，可讀出較長的序列，2）標(biāo)記DNA3’隱蔽末端和更有效地補(bǔ)平末端。6、末端轉(zhuǎn)移酶：罕見的 DNA聚合酶：從小牛胸腺中純化出的堿性蛋白質(zhì)，催化單鏈或雙鏈 DNA分子的3’-OH末端添加一個至多個脫氧核苷酸的反應(yīng)。用途：1）在載體或cDNA上加換互補(bǔ)的同源多聚尾，以便連接。2）標(biāo)記DNA片段的3’末端。（3）快速擴(kuò)增 cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA End簡稱為RACE）。7、反轉(zhuǎn)錄酶（依賴 RNA的DNA聚合酶）（Reversetranscriplase,RT ）用途：合成cDNA。以oligodT 為引物（與 mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。四、RNA聚合酶：1、依賴DNA的RNA聚合酶包括：E.coliRNA 聚合酶，phageSP6、T7和T3RNA聚合酶以DNA為模板，從啟動子開始，經(jīng)過延伸、終止，合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。用途：A：合成單鏈 RNA探針 B ：體外翻譯，基因表達(dá)分析2、不依賴 DNA的RNA聚合酶 ：多聚（A）聚合酶，ATP存在下，催化在單鏈 RNA3’末端加上 AMP，任何RNA可作底物 。用途：A：在RNA末端加上多聚（ A）尾，以合成 cDNA；B：標(biāo)記RNA的3’端 。第四節(jié) 修飾酶修飾酶：主要為三類：末端轉(zhuǎn)移酶（在 DNA聚合酶中已述），堿性磷酸酶，多核苷酸激酶多核苷酸激酶的用途： DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記 DNA的5’端。堿性磷酸酶（ alkalinephosphatase ，AP）種類：細(xì)菌性堿性磷酸酶、小牛腸堿性磷酸酶用途：A：載體5’末端脫磷，防止載體自我環(huán)化。B：在RNA/DNA末端除去 5’磷酸，便于標(biāo)記 5’末端 。四基因工程技術(shù)凝膠電泳技術(shù)電泳（electroghoresis ）：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象 。電泳技術(shù)：就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。18/26電荷效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動：垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。電泳遷移率：是指在單位電場強(qiáng)度（ 1V/cm）時帶電分子的遷移速度。遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。影響凝膠電泳遷移率的因素（一）樣品的物理性質(zhì)1、分子大小 ：線狀雙鏈 DNA分子長度（堿基對數(shù)目 bp）的對數(shù)（log10）與遷移距離成反比，以此來測定 DNA片段（線性雙鏈）的分子量準(zhǔn)確且方便