植物脫毒技術(shù)

第3章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第一種類型為曾經(jīng)或正在大面積或高比率發(fā)生，并造成嚴(yán)重為害的植原體病害，主要包括棗瘋病和泡桐叢枝病。第二類型為局部或零星發(fā)生病害類型，山楂叢枝病嚴(yán)重地區(qū)約占20%左右。桃樹(shù)黃化病和紅葉病的發(fā)生面積較大，

第三種類型為國(guó)內(nèi)外引種或國(guó)內(nèi)苗木調(diào)運(yùn)而傳入病害類型，比較典型的為從以色列引進(jìn)的櫻桃扁枝病和黃化病。1995年北京中以示范農(nóng)場(chǎng)從以色列引進(jìn)一年生的經(jīng)嫁接的6個(gè)歐洲櫻桃品系的苗木3500株，栽植當(dāng)年即發(fā)現(xiàn)患帶化病苗木，1995～1996年度的發(fā)病率為3%。在從國(guó)內(nèi)其它地區(qū)引入的櫻桃、棗樹(shù)、泡桐等新品種苗木上也都發(fā)現(xiàn)帶病苗木。

第一節(jié)

植物脫毒的意義一、病毒病危害第三章植物脫毒技術(shù)二、植物脫毒的意義

“脫毒苗”或“無(wú)病毒苗”，是指不含有該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測(cè)主要病毒在植物體內(nèi)的存在表現(xiàn)為陰性反應(yīng)的苗木。通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無(wú)病毒種苗可以同時(shí)除去真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)的寄生，因此產(chǎn)量大幅度增加，最高可增產(chǎn)300％，平均增產(chǎn)也在30％以上。棗瘋病辣椒病毒病番茄病毒病第三章植物脫毒技術(shù)第二節(jié)植物脫毒方法一、莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒二、熱處理脫毒三、熱處理結(jié)合莖尖脫毒四、其它脫毒方法第三章植物脫毒技術(shù)一、莖尖分生組織脫毒(一）通過(guò)莖尖培養(yǎng)脫毒的原理1、病毒在植物體內(nèi)的分布莖尖和根尖分生組織不含病毒粒子或病毒濃度很低，是因?yàn)椴《驹诩闹髦参矬w內(nèi)隨著維管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，在根尖與莖尖分生組織中沒(méi)有維管束系統(tǒng)，病毒運(yùn)動(dòng)很困難。病毒在寄主莖尖分生組織中的轉(zhuǎn)移速度落后于莖尖的生長(zhǎng)速度，導(dǎo)致頂端分生組織附近病毒濃度低，甚至不帶病毒，通過(guò)莖尖（根尖）離體培養(yǎng)便可獲得無(wú)病毒再生植株。2、莖尖大小與脫毒效果用于脫毒的莖尖外植體可以是頂端分生組織即生長(zhǎng)點(diǎn)，最大直徑0.1mm，也可以是帶1－3個(gè)葉原基的莖尖。莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比。外植體過(guò)小，存活困難，生長(zhǎng)緩慢，操作難度大。但莖尖外植體過(guò)大，脫毒效果差。通常以帶1－3個(gè)幼葉原基的莖尖作外植體較合適。第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)（二）莖尖脫毒的方法1、取樣與消毒取病害相對(duì)較輕的植株，可以從選定的植株上取頂芽梢段進(jìn)行消毒接種。也可從室內(nèi)培養(yǎng)1－2個(gè)月并進(jìn)行熱處理的盆栽扦插苗上，采頂芽與側(cè)芽消毒接種，消毒方法：取頂芽梢段3－5cm，剝?nèi)ゴ笕~片，自來(lái)水沖洗，75％酒精浸泡30秒左右，用0.1％升汞消毒10分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗4－5次。第三章植物脫毒技術(shù)2、撥取莖尖與接種在超凈工作臺(tái)上，用解剖刀將仔細(xì)剝離幼葉，至出現(xiàn)裸露的生長(zhǎng)點(diǎn)，用刀尖切下帶1－2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)，將切下的莖尖轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基上，每管接1－2個(gè)莖尖。第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)3、培養(yǎng)接種后的材料在25±2℃，每天光照10－16h條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2個(gè)月左右，在莖尖再生出小綠芽，小的莖尖則需3個(gè)月以上，有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間才發(fā)生綠芽。其間應(yīng)更換新鮮培養(yǎng)基。4、生根誘導(dǎo)一些植物莖尖培養(yǎng)形成綠芽后，基部很快發(fā)生不定根，而另一些植物不產(chǎn)生不定根，必須將無(wú)根綠苗再誘導(dǎo)，才能生根成為完整植株。方法：將2－3cm高的無(wú)根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1－2個(gè)月即可形成根。第三章植物脫毒技術(shù)莖尖培養(yǎng)脫毒過(guò)程圖

第三章植物脫毒技術(shù)

莖尖剝離（1）第三章植物脫毒技術(shù)

莖尖剝離（2）第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)（三）影響莖尖脫毒培養(yǎng)的因素

（1）莖尖大小：莖尖大小與脫除病毒的效果成反相關(guān)，即剝?nèi)∏o尖越小，脫毒效果越好。但莖尖大小與莖尖的成活率成正相關(guān)，即莖尖越小培養(yǎng)難度越大，成活率越低。考慮到脫毒效果及提高成活率，一般切取0.2～0.5mm帶1～2個(gè)葉原基的莖尖為培養(yǎng)材料。（2）培養(yǎng)條件：在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好。（3）外植體的生理狀態(tài)：莖尖最好從活躍生長(zhǎng)的芽上切取，一般地培養(yǎng)頂芽莖尖比培養(yǎng)腋芽莖尖效果好。第三章植物脫毒技術(shù)二、熱處理脫毒1.原理利用病毒耐熱性差的特點(diǎn)，將植物組織置于高于正常溫度的環(huán)境中，組織內(nèi)部的病毒受熱以后部分或全部鈍化，但寄主植物的組織很少或不會(huì)受到傷害。第三章植物脫毒技術(shù)2.熱處理的方法(1)溫湯浸漬處理適用于休眠器官、剪下的接穗或種植材料的脫毒處理。方法是將材料放在50～55℃的溫水中浸漬數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。此方法簡(jiǎn)便易行，但易造成材料受傷。(2)熱空氣處理適用于生長(zhǎng)期植物材料的脫毒處理。設(shè)備可采用有照明、通風(fēng)、調(diào)溫、給水動(dòng)能的培養(yǎng)箱。方法是將待處理植株先進(jìn)行盆栽，成活后移入35～40℃的培養(yǎng)箱中處理幾十分鐘至幾個(gè)月。第三章植物脫毒技術(shù)3.熱處理脫毒的優(yōu)點(diǎn)與局限性(1)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)設(shè)備要求不高，技術(shù)簡(jiǎn)單，短時(shí)間可除去病毒。(2)局限性：●熱處理不能脫除所有病毒，此法只對(duì)那些球形病毒和線形病毒有效。而對(duì)桿狀病毒不起作用。●同時(shí)同樣的處理效果也不一樣（具有不確定性）。●對(duì)植株有傷害，只有部分植株成活。●對(duì)寄主植物進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理有可能鈍化植物組織中的阻抗因子，使寄主植物中抗病毒因子難于活化，從而增加無(wú)效植株的發(fā)生率。第三章植物脫毒技術(shù)三、熱處理結(jié)合莖尖脫毒1把切取的草莓芽洗凈后2先經(jīng)過(guò)高溫短時(shí)間熱處理，殺死部分病毒；3然后在無(wú)菌條件下對(duì)經(jīng)過(guò)處理的材料，在解剖鏡下解剖，4切取分生組織尖端0.2-0.3mm生長(zhǎng)點(diǎn)，5迅速接種到最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基上，在25℃下暗培養(yǎng)。6待長(zhǎng)出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，7接種到另一種叢芽培養(yǎng)基上，即產(chǎn)生叢生芽及綠苗。8將綠苗接種在生根培養(yǎng)基上，920天后待根長(zhǎng)2-5cm時(shí)即可煉苗移栽，成活率達(dá)到95%以上。

第三章植物脫毒技術(shù)四、其它組織培養(yǎng)脫毒方法（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒將感染病毒的組織離體培養(yǎng)獲得愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗，從而獲得無(wú)病毒植株的方法（二）珠心胚培養(yǎng)脫毒柑橘類種子多為多胚種子，除具有合子胚外，還有多個(gè)珠心胚。珠心胚由珠心組織細(xì)胞即體細(xì)胞分化形成，具有和母體相同的遺傳特性。病毒一般不通過(guò)種子傳播，因而通過(guò)珠心胚培養(yǎng)獲得的再生植株是無(wú)毒的，同時(shí)保存了母株的遺傳特性。第三章植物脫毒技術(shù)（三）莖尖微體嫁接第三章植物脫毒技術(shù)試管內(nèi)嫁接法接穗砧木培養(yǎng)基無(wú)毒苗微枝莖尖第三章植物脫毒技術(shù)（四）花藥培養(yǎng)脫毒草莓花藥培養(yǎng)可產(chǎn)生無(wú)病毒植株。草莓花藥培養(yǎng)脫毒率高于莖尖脫毒苗率，一般可達(dá)80％以上，有些報(bào)道可達(dá)100％

第三章植物脫毒技術(shù)（五）低溫處理

低溫處理又稱冷療法。適當(dāng)增加低溫處理時(shí)間可提高脫毒效果。菊花植株在5℃下，經(jīng)4－7.5個(gè)月處理后，切取莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，可以有效去除菊花矮化病毒與菊花褪綠斑駁病毒，僅莖尖培養(yǎng)則無(wú)此效果，目前低溫脫毒的報(bào)道尚少，但不失為一種脫毒的方法。第三章植物脫毒技術(shù)（六）化學(xué)處理許多化學(xué)藥品（包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等）在植物體內(nèi)和植物葉片內(nèi)，進(jìn)行其抑制病毒的增殖或使之不活化的測(cè)定，在某種程度上抑制了病毒的增值或不活化。整株植物用化學(xué)療法不能除去病毒，但離體培養(yǎng)和原質(zhì)體培養(yǎng)效果明顯。第三章植物脫毒技術(shù)第三節(jié)脫毒苗的鑒定

（一）指示植物檢測(cè)法（二）抗血清檢測(cè)法（三）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（四）其它鑒定方法第三章植物脫毒技術(shù)（一）指示植物檢測(cè)法

指示植物檢測(cè)是利用病毒在植物體上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的依據(jù)，也叫枯斑測(cè)定法。這種專門(mén)用以產(chǎn)生局部病斑的寄主稱為指示植物，又稱鑒別寄主。第三章植物脫毒技術(shù)1.汁液涂抹法：待鑒試管苗取幼葉1-3g加水和磷酸緩沖液研磨紗布過(guò)濾指示植物上涂一薄層金剛砂手指蘸濾液摩擦5min后沖去葉面汁液和金剛砂至于溫室中2-6天觀察沒(méi)有出現(xiàn)不含病毒出現(xiàn)枯斑有病毒第三章植物脫毒技術(shù)2.嫁接鑒定法：

適用于木本多年生果樹(shù)和草莓、甘薯等無(wú)性繁殖的草本植物，采用汁液接種法比較困難，通常采用嫁接接種的方法，以指示植物作砧木，被檢測(cè)植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接。第三章植物脫毒技術(shù)對(duì)指示植物的要求應(yīng)根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物。所選指示植物一年四季都容易栽培。能夠在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持對(duì)病毒的敏感性。容易接種。較廣的范圍內(nèi)具有同樣的反映。指示植物一般有兩種類型：一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其出現(xiàn)在病毒擴(kuò)展到的植物非接種部位，通常沒(méi)有局部病斑明顯；另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑構(gòu)成。第三章植物脫毒技術(shù)指示植物檢測(cè)法的優(yōu)缺點(diǎn)

(1)優(yōu)點(diǎn)：條件簡(jiǎn)單，操作方便，是一種經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)方法，所以大多數(shù)植物檢測(cè)用指示植物檢測(cè)法。

(2)缺點(diǎn)：不能測(cè)出病毒總的核蛋白濃度，而只能測(cè)出病毒的相對(duì)感染力。第三章植物脫毒技術(shù)（二）抗血清檢測(cè)法

抗體是動(dòng)物在外來(lái)抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，抗體主要存在于血清中，含有抗體的血清即稱為抗血清。不同病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特異性，因此抗血清在病毒的檢測(cè)中成為一種高度?；缘脑噭?，其特異性高，檢測(cè)速度快，一般幾小時(shí)甚至幾分鐘可以完成。第三章植物脫毒技術(shù)1.檢測(cè)方法抗原的制備：病毒的接種繁殖→病葉的研磨→病毒的提純。抗血清的制備：動(dòng)物的選擇和飼養(yǎng)→抗原的注射→抗血清的采集（采血）→抗血清的分離→抗血清的保藏。抗血清檢測(cè)（免疫反應(yīng)）：有葉綠體凝聚法、塊莖沉淀法、環(huán)形接口法、酶聯(lián)免疫法等方法。第三章植物脫毒技術(shù)2.抗血清檢測(cè)法的優(yōu)缺點(diǎn)(1)優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高；操作簡(jiǎn)便、安全、快速；無(wú)需特殊儀器設(shè)備，結(jié)果容易判斷；可同時(shí)檢測(cè)大量的樣品。

(2)缺點(diǎn)：抗血清來(lái)源困難，成本高，常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用較少。第三章植物脫毒技術(shù)（三）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

第三章植物脫毒技術(shù)第三章植物脫毒技術(shù)（四）其它鑒定方法

病毒顆粒一般小于0.1um的微粒，人的眼睛觀察不到，光學(xué)顯微鏡僅觀察200nm的微粒，而電子顯微鏡則將分辨能力增大至0.5nm。通過(guò)電子顯微鏡在病毒的薄樣品或部分純化的病毒懸浮液中容易觀察到。采用電子顯微鏡法鑒定病毒，直接觀察有無(wú)病毒顆粒存在，并觀察有關(guān)病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu)，由于這些特征穩(wěn)定，對(duì)病毒鑒定有很大的作用。這種檢測(cè)方法，需要一定的設(shè)備，常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用較少。1、電鏡檢測(cè)法第三章植物脫毒技術(shù)2、分子生物學(xué)檢測(cè)法

待測(cè)脫毒植物病毒總DNA序列

ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC

TGCCCAATAGCCA引物

TGCCC隨機(jī)引物ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGACTGCCCAATAGCCAGCTTATTGTGGCCCTTAAAATGCTAAT

TGCCCTGCCCACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGACTGCCCAATAGCCAGCTTATTGTGCCCGTTAAAATGCTAATCTGATTGCCCCTCTGTGCCCTGCCCTGCCC（1）PCR檢測(cè)法第三章植物脫毒技術(shù)病毒標(biāo)準(zhǔn)譜帶待測(cè)植物譜帶A隨機(jī)引物B已知引物1kb300025001500800400100病毒標(biāo)準(zhǔn)譜帶待測(cè)植物譜帶12345678待測(cè)植物無(wú)譜帶瓊脂凝電泳板

瓊脂凝電泳板+-第三章植物脫毒技術(shù)（2）核酸雜交技術(shù)(NAH)

NAH技術(shù)是根據(jù)單鏈可以相互結(jié)合的原理，將一段病毒特異的核酸序列加以標(biāo)記制成探針，再與待測(cè)樣品的核酸雜交，雜交信號(hào)能指示病毒的存在。核酸雜交技術(shù)適用于DNA、RNA病毒及類病毒的檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高的特點(diǎn)。目前根據(jù)病毒檢測(cè)的需要，可以制備用于檢測(cè)單一病毒的單特異性探針和用于檢測(cè)多種病毒的復(fù)合探針。包括核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)、核酸狹縫印跡雜交技術(shù)、Northern印跡等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)。（3）雙鏈RNA(dsRNA)電泳技術(shù)

在受RNA病毒侵染的植物體內(nèi),有相應(yīng)復(fù)制形式的雙鏈RNA存在,而在健康植株中未發(fā)現(xiàn)病毒的dsRNA,如果檢測(cè)到植物體內(nèi)有dsRNA存在，它只能是病毒和類病毒以單鏈RNA（ssRNA）為模板合成的，因此，dsRNA可作為病毒檢測(cè)的標(biāo)志。病毒在植物體內(nèi)增殖，通過(guò)核酸互補(bǔ)而形成一種健康植物沒(méi)