生物顯微技術(shù) 第二章 切片的制作

生物顯微技術(shù)第二章切片的制作第一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三石蠟切片的過程動(dòng)物的處死動(dòng)物組織取材固定組織固定后的處理脫水和透明包埋切片第二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三一、動(dòng)物的處死麻醉空氣栓塞頸椎脫臼或斷頭股動(dòng)脈放血第三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三二、動(dòng)物組織取材動(dòng)物組織取材原則：盡量保持組織的生活狀態(tài)。動(dòng)作要快不要過度用力夾捏組織，防止組織變形。第四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三三、固定1、目的：盡量保持組織的生前狀態(tài)，防止組織的死后變化、自溶。保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織內(nèi)部成分特征不發(fā)生變化。2、方式：浸入式灌注式第五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三灌注式此法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。自左心室插入主動(dòng)脈，先以生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。灌注法固定可使固定液迅速達(dá)到全身各組織。達(dá)到充分固定之目的。第六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三3、固定液醛類固定劑非醛類固定劑丙酮及醇類固定劑第七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三醛類固定劑雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)。包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛通常與其他的試劑聯(lián)合使用優(yōu)點(diǎn)是對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。可以保存蛋白質(zhì)、脂肪、黏液物質(zhì)以及一定量的糖原。缺點(diǎn)：長(zhǎng)期固定使組織過度硬化及細(xì)胞核不著色，并且產(chǎn)生“福爾馬林色素”，它是由于血紅蛋白與甲醛轉(zhuǎn)化的酸形成正鐵血紅素。第八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三非醛類固定劑氯化汞（HgCI2）：蛋白的強(qiáng)固定劑重鉻酸鉀：保存類脂、高爾基復(fù)合體、及染色體等結(jié)構(gòu)。苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定劑，醋酸：固定染色體。軟化組織，緩解收縮。蔗糖：防止某些細(xì)胞成分?jǐn)U散，保持酶活性，良好形態(tài)。四氧化鋨：保存細(xì)胞蛋白質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)有良好效應(yīng)，應(yīng)用與電鏡觀察切片的固定與染色。第九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三丙酮及醇類固定劑丙酮：沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)。可以單獨(dú)使用，低溫下保持酶活性效果好。乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差。必須與其他試劑混合使用，單獨(dú)使用使組織收縮嚴(yán)重，對(duì)細(xì)胞形態(tài)保存不良。第十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三混合固定劑固定組織時(shí)，單獨(dú)使用一種固定劑很難對(duì)組織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑混用，制成混合固定劑。以求得補(bǔ)償某試劑對(duì)組織所致的缺陷。第十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4成分：4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸緩沖液中，1倍的磷酸緩沖液:PBSMV

NaCl140mM58.44KCl2.7mM74.55NaH2PO4?12H2O，10mM358.14KH2PO41.8mM136.09

調(diào)pH至7.4。

第十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三Bouin’s液苦味酸飽和水溶液75ml15固定糖原37%-40%福爾馬林液25ml5固定蛋白和脂肪冰醋酸5ml1凝固核染色質(zhì)第十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三固定組織時(shí)應(yīng)注意：①應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。第十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三固定時(shí)間的選擇不同的研究目的所需使用的固定液。材料的大小，組織的特性與致密度。溫度的不同有所差別。第十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三組織固定后的處理沖洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。修塊:大小合適、去除形態(tài)不好的部分，第十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三四、脫水脫水目的：運(yùn)用某種溶劑置換組織內(nèi)的水分。脫水劑：乙醇、丙酮、正丁醇等第十七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三乙醇：最常用的脫水劑一般組織：70%---80%----90%--100%---100%特殊組織：30%--40--%--50%---60%---70%---80%---90%--100%---100%每步30分鐘左右。要求：完全脫凈，保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間

不能過度脫水（使組織變脆）不同組織脫水時(shí)間不同：大的致密的組織需要延長(zhǎng)脫水時(shí)間為加速各級(jí)酒精的穿透力，脫水可在37℃溫箱中進(jìn)行。

第十八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三五、透明或媒浸目的與作用對(duì)組織的最后脫水處理與包埋劑置換透明劑：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有機(jī)溶劑100%乙醇脫水后進(jìn)入二甲苯兩次，保證透明完全。第十九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三六、包埋包埋劑的特點(diǎn)：具有一定的強(qiáng)度和韌度，滿足切片的要求。能完全進(jìn)入組織。對(duì)組織內(nèi)部成分損傷小。第二十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三石蠟包埋石蠟特點(diǎn)：熔點(diǎn)：45-50℃軟蠟

55-60℃硬蠟常用石蠟的處理：新蠟應(yīng)溶一次，增加密度。并用濾紙過濾去處雜質(zhì)。加5%~10%的蜂蠟,增加石蠟的韌性。反復(fù)溶的舊蠟包埋效果更好。程序：在溶蠟箱中進(jìn)行55-60℃，恒溫。浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯：石蠟（1：1）中兩次，在石蠟中兩次，每次一個(gè)小時(shí)左右。包塊：在室溫進(jìn)行第二十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三第二十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三第二十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三七石蠟切片載玻片處理：切片：展片：背面與玻片。烘片：37℃的溫箱內(nèi)烤干(約需12小時(shí))。第二十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三優(yōu)點(diǎn)：操作比較簡(jiǎn)便、容易，可以切出較薄的切片，并且易于制成連續(xù)切片，也容易附著于載玻片上。缺點(diǎn)：是不適于較大的標(biāo)本，材料在經(jīng)過脫水、浸蠟的過程中容易收縮。第二十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三火棉膠切片法透明劑：乙醚與乙醇等量混合包埋劑：火棉膠溶于透明劑包埋：常溫進(jìn)行凝固：在乙醚中過夜，在氯仿中過夜。在70%乙醇中保存。第二十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期三優(yōu)點(diǎn)：可切大的組織可切較硬的組織如硬骨缺點(diǎn)：操作所用時(shí)