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文檔簡(jiǎn)介

演示文稿基因的定位克隆當(dāng)前第1頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)(優(yōu)選)基因的定位克隆當(dāng)前第2頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)千奇百怪的突變體這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢?突變體:是某個(gè)性狀發(fā)生可遺傳變異的材料,或某個(gè)基因發(fā)生突變的材料。水稻當(dāng)前第3頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

基因定位(mapping):是用一定的方法將基因確定到染色體上的實(shí)際位置。當(dāng)前第4頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)一、連鎖分析(Linkageanalysis)1)概念:基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列,不同基因相互連鎖成連鎖群的原理,即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。當(dāng)前第5頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)2)重組值(recombinationfraction)

是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度,即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值,其遺傳圖的距離為1厘摩。(centimorgan,cM)交換值(RF)(%)=重組型的配子數(shù)/總配子數(shù)×100%

重組值越大,說明兩基因間的距離越遠(yuǎn),基因間的連鎖強(qiáng)度越??;重組值越小,說明基因間的距離越近,基因間的連鎖強(qiáng)度越大。當(dāng)前第6頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

3)遺傳標(biāo)記(geneticmarker)用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的DNA序列作為遺傳標(biāo)記,這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳,標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。

4)遺傳多態(tài)性:是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因,且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。當(dāng)前第7頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)二、三點(diǎn)測(cè)交(three-pointtestcross)與染色體作圖

為了進(jìn)行基因定位,摩爾根和他的學(xué)生Sturtevant創(chuàng)造了三點(diǎn)測(cè)交方法,即將3個(gè)基因包括在同一次交配中。進(jìn)行這種測(cè)交,一次實(shí)驗(yàn)就等于3次兩點(diǎn)試驗(yàn)。已知在果蠅中棘眼(ec)、截翅(ct)和橫脈缺失(cv)這3個(gè)隱性突變基因都是X連鎖的。把棘眼、截翅個(gè)體與橫脈缺失個(gè)體交配,得到3個(gè)基因的雜合體ecct+/++cv(ec、ct、cv的排列不代表它們?cè)赬染色體的真實(shí)順序),取其中3雜合體雌蠅再與3隱性體ecctcv/Y雄蠅測(cè)交,測(cè)交后代如下表。當(dāng)前第8頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)序號(hào)表型實(shí)得數(shù)1ecct+2125親本型2++cv22073ec+cv273單交換I型4+ct+2655ec++217單交換II型6+ctcv2237+++5雙交換型8ecctcv3合計(jì)5318ecct+/++cv×ecctcv/Y測(cè)交后代數(shù)據(jù)當(dāng)前第9頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)結(jié)果分析1、歸類2、確定正確的基因順序用雙交換型與親本類型相比較,發(fā)現(xiàn)改變了位置的那個(gè)基因一定是處于中央的位置,因?yàn)殡p交換的特點(diǎn)是旁側(cè)基因的相對(duì)位置不變,僅中間的基因發(fā)生變動(dòng)。于是可以斷定這3個(gè)基因正確排列順序是eccvct。親本型ecct+++cv雙交換型+++ecctcv當(dāng)前第10頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)ecct+++cvec+ct+cv+ctec+++cvec+++ctcveccvct+++ct+++eccv當(dāng)前第11頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)3、計(jì)算重組值,確定圖距(1)、計(jì)算ct—cv的重組值忽視表中第一列(ec/+)的存在,將它們放在括弧中,比較第二、三列:(ec)ct+2125非重組(+)+cv2207(ec)+cv273非重組(+)ct+265(ec)++217重組(+)ctcv223(+)++5重組(ec)ctcv3ct—cv間重組率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cM當(dāng)前第12頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)(3)、計(jì)算ec—ct的重組值忽視表中第三列(+/cv)的存在,將它們放在括弧中,比較第一、二列:ecct(+)2125非重組++(cv)2207ec+(cv)273重組+ct(+)265ec+(+)217重組+ct(cv)223++(+)5非重組ecct(cv)3ec—ct間重組率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cM當(dāng)前第13頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)(2)、計(jì)算ec—cv的重組值忽視表中第二列(ct/+)的存在,將它們放在括弧中,比較第一、三列:ec(ct)+2125非重組+(+)cv2207ec(+)cv273重組+(ct)+265ec(+)+217非重組+(ct)cv223+(+)+5重組ec(ct)cv3ec—cv間重組率=(273+265+5+3)/5318=10.2%=10.2cM當(dāng)前第14頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)4、繪染色體圖eccvct10.28.418.418.6在計(jì)算ec—cv和cv—ct的重組值時(shí)都利用了雙交換值,可是計(jì)算ec—ct時(shí)沒把它計(jì)在內(nèi),因?yàn)樗鼈冮g雙交換的結(jié)果并不出現(xiàn)重組。所以ec—ct之間的實(shí)際雙交換值應(yīng)當(dāng)是重組值加2倍雙交換值。即18.4%+2×0.1%=18.6%。當(dāng)三點(diǎn)測(cè)交后代出現(xiàn)8種表型時(shí),表明有雙交換發(fā)生,此時(shí)需用2倍雙交換值來作校正。若3個(gè)基因相距較近,往往不出現(xiàn)雙交換類型,后代只有6種表型,無需校正。標(biāo)記1標(biāo)記2目標(biāo)基因當(dāng)前第15頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)三、圖位克隆圖位克?。╩ap-basedcloning)又稱定位克隆,該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法,其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對(duì)穩(wěn)定的基因座,在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上,使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫(kù),從而構(gòu)建的基因區(qū)域的物理圖譜,再利用此物理圖譜通過染色體步行(chromosomewalking)逼近目的基因或通過染色體登陸(chromosomelanding)(Tanksleyetal.,1995)的方法最終找到包含目的基因的克隆,最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿基序列。當(dāng)前第16頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

圖位克隆的特點(diǎn)是無需預(yù)先知道基因的DNA順序,也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息,但應(yīng)有以下兩方面的基本情況。

一是有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,即定位群體,如:F2、DH、BC、RI等。當(dāng)前第17頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

二是開展以下幾項(xiàng)工作:(1)首先找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記;(2)用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體上的特定位置;(3)構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(kù);(BAC或YAC);(4)以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù);(5)用獲得陽(yáng)性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群;(6)通過染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目的基因的大片段克隆;(7)通過亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??;(8)通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列當(dāng)前第18頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)M1M2構(gòu)建遺傳圖譜構(gòu)建物理圖譜染色體步移:ChromosomeWalking篩選基因組文庫(kù)序列分析與功能鑒定對(duì)于基因組還未測(cè)序的物種可通過染色體步移的方法進(jìn)行定位,但是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而對(duì)于水稻、擬南芥等基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成的物種,則不在利用染色體步移的方法進(jìn)行定位,直接從構(gòu)建遺傳圖譜到構(gòu)建物理圖譜,最后確定目標(biāo)基因的候選基因,再通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)前第19頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)四、分子標(biāo)記分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記,是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映?,F(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種,廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。

當(dāng)前第20頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)分子標(biāo)記的種類

一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù):限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)

二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù):①隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA,RAPD)②簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)三、基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記:①擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)

四、基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù):核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)

當(dāng)前第21頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

SSR即微衛(wèi)星DNA,是一類由幾個(gè)(多為1-5個(gè))堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列,其長(zhǎng)度一般較短,廣泛分布于基因組的不同位置,如(CA)n、(AT)n、(GGC)n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性,導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性,這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置,但其兩端序列多是保守的單拷貝序列,因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來,利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性,即SSR標(biāo)記。

SSR當(dāng)前第22頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)五、基因初步定位

目的基因的初步定位(mappingthetargetgene)是利用分子標(biāo)記技術(shù)在一個(gè)目標(biāo)性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區(qū)域內(nèi)。初定位通常使用近等基因系法(near-isogeniclines,NILs)或群組分離分析法(bulksegregantanalysis,BSA)。當(dāng)前第23頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)近等基因系是指只有目標(biāo)性狀基因有差異,其它性狀基因相同的2個(gè)群體,可以通過連續(xù)回交的途徑獲得。由于近等基因系需要連續(xù)的回交,所需的時(shí)間較長(zhǎng),因此Michelmore等(1991)提出了群組分離分析法(BSA法),將分離群體中研究的目標(biāo)性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組,將每組內(nèi)一定數(shù)量的植株DNA等量混合,形成兩個(gè)池,這兩個(gè)池僅在目標(biāo)性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找兩個(gè)池的擴(kuò)增譜帶的差異,這種多態(tài)性極可能與目標(biāo)基因連鎖。再用所有的分離后代單株,驗(yàn)證該多態(tài)性是否真正與目標(biāo)基因連鎖及連鎖距離的確定。當(dāng)前第24頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)六、精細(xì)定位

在初步定位基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)并篩選離親本更近且在兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物,然后利用F2群體中的突變體檢測(cè)篩選到的親本間多態(tài)性引物,逐步縮小范圍,將目的基因定位到染色體上一個(gè)很小的物理區(qū)間內(nèi)。當(dāng)前第25頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)舉例說明:利用SSR標(biāo)記進(jìn)行水稻drawf1基因的定位當(dāng)前第26頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)基本實(shí)驗(yàn)方法F2定位群體構(gòu)建植物總DNA的提取PCR反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳引物設(shè)計(jì)當(dāng)前第27頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)F2群體構(gòu)建當(dāng)前第28頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)引物設(shè)計(jì)常用軟件及網(wǎng)站設(shè)計(jì)軟件:primer3.0primer5.0(尋找酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物)Webprimer序列分析軟件:DNAstar(分析序列特征,引物質(zhì)量,編輯序列)當(dāng)前第29頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)基因的初步定位(BSA法)篩選親本間多態(tài)性引物篩選池間多態(tài)性引物小群體驗(yàn)證當(dāng)前第30頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)初步定位帶型分析正常親本突變親本突變池正常池RM1(親本之間有多態(tài),池間無多態(tài))當(dāng)前第31頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)RM2(親本和池之間均有多態(tài))正常親本突變親本突變池正常池當(dāng)前第32頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

總結(jié):如果親本與池之間同時(shí)存在多態(tài)性的引物很有可能和目標(biāo)基因連鎖,因此再通過小群體進(jìn)行驗(yàn)證(重組交換值應(yīng)該小于50%),則可將目標(biāo)基因定位到與其連鎖的標(biāo)記所在的染色體上。我們初步定位的結(jié)果是否準(zhǔn)確呢???接下來就要用一些突變體進(jìn)行驗(yàn)證,看一下我們所選定的標(biāo)記與目標(biāo)基因是否真正連鎖當(dāng)前第33頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)遺傳距離=(單交換+雙交換×2)/(突變體總數(shù)×2)×100%

引物名稱連鎖植株數(shù)目單交換植株數(shù)目雙交換植株數(shù)目RM1150191RM2158111RM316280RM4155150怎樣判斷目標(biāo)基因與這些標(biāo)記之間的位置關(guān)系及距離遠(yuǎn)近呢???當(dāng)前第34頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

AP+-51018AP+-6111216RM2RM3當(dāng)前第35頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

交換率越高的標(biāo)記離目標(biāo)基因越遠(yuǎn),反之離目標(biāo)基因越近,即對(duì)應(yīng)的交換株越多的標(biāo)記離目標(biāo)基因遠(yuǎn),交換株越少的標(biāo)記離目標(biāo)基因越近。當(dāng)前第36頁(yè)\共有43頁(yè)\編于星期五\4點(diǎn)

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