蘭花細(xì)菌性褐腐病菌檢疫鑒定方法

I蘭花細(xì)菌性褐腐病菌檢疫鑒定方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的分離培養(yǎng)、生理生化特征及分子生物學(xué)等檢測(cè)鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘭花植株中蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的檢測(cè)鑒定及該病害的田間調(diào)查與監(jiān)測(cè)。蘭花細(xì)菌性褐腐病菌基本信息中文名：蘭花細(xì)菌性褐腐病菌，杓蘭歐文氏菌學(xué)名：Erwiniacypripedii（hori）Bergeyetal.1923異名：Pectobacteriumcypripedii（hori）Brenneretal.1973Pantoeacypripedii英文名：Bacterialsoftrotoforchid分類(lèi)地位：細(xì)菌域Bacteria，變形菌門(mén)Proteobacteria，γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，腸桿菌目Enterobacteriales，腸桿菌科Enterobacteriaceae，歐文氏菌屬Erwinia。傳播途徑：遠(yuǎn)距離傳播主要靠帶菌種苗，近距離傳播主要借助葉面澆水、噴霧或施肥而將病原菌散播至健康植株上，通過(guò)葉片傷口及自然孔口侵染，造成二次感染。原理根據(jù)蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的特異性DNA序列進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)；根據(jù)蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的培養(yǎng)性狀、生物學(xué)特性、寄主范圍及危害癥狀等對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及致病性測(cè)定。儀器設(shè)備和主要試劑儀器設(shè)備及用具PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、Biolog儀、顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、水浴鍋、臺(tái)式小型離心機(jī)、超低溫冰箱、常規(guī)冰箱、旋渦振蕩器、微量可調(diào)加樣器、剪刀、解剖刀、玻璃棒、接種環(huán)、鑷子、培養(yǎng)皿、酒精燈、三角燒瓶、量筒、離心管、濾紙等。主要試劑除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用分析純?cè)噭┖腿ルx子水。PCR反應(yīng)體系用雙蒸水。商品化試劑參見(jiàn)其使用說(shuō)明。NA培養(yǎng)基配制方法:蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化鈉5g，X脂17g，調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，121℃高壓滅菌15min。田間觀察檢測(cè)參照附錄A中的癥狀描述觀察植株是否有蘭花細(xì)菌性褐腐病的典型癥狀，對(duì)出現(xiàn)典型癥狀或可疑癥狀的植株進(jìn)行拍照記錄，并采集表現(xiàn)癥狀植株送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)鑒定，田間無(wú)癥狀植株可隨機(jī)采樣。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品制備選擇有褐腐癥狀的植株，用脫脂棉蘸取75%乙醇擦拭病部表面進(jìn)行表面消毒，用滅菌剪刀剪取新鮮病葉上的病健交界部位（無(wú)癥狀樣品，隨機(jī)選取葉片）組織置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用75%的乙醇（或1%的次氯酸鈉）表面消毒50s～60s，無(wú)菌水清洗3次，然后將其移至滅菌培養(yǎng)皿中，加適量無(wú)菌水，用滅菌玻棒或剪刀搗碎組織，靜置15min～20min后，即制成組織懸浮液，用于分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)檢測(cè)。分子生物檢測(cè)模板制備按照6.1的方法制備成樣品懸浮液后，直接用商業(yè)化植物基因組DNA提取試劑盒按照操作說(shuō)明提取樣品總DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。?duì)于分離培養(yǎng)得到的疑似菌株，可直接或經(jīng)裂解處理后（97℃沸水浴10min；12000g離心10min，取上清液，-20℃保存）作為分子生物學(xué)檢測(cè)反應(yīng)模板。常規(guī)PCR檢測(cè)對(duì)于葉片等植株樣品，以已知帶菌的蘭花植株組織作陽(yáng)性對(duì)照（若無(wú)已知帶菌材料，可用模擬帶菌方式代替），以健康的蘭花植株組織作陰性對(duì)照，以雙蒸水代替模板作為空白對(duì)照，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于純培養(yǎng)菌株，以E.cypripedii標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照，用非E.cypripedii的植物細(xì)菌作陰性對(duì)照，以雙蒸水代替模板作為空白對(duì)照，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR凝膠電泳檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟見(jiàn)附錄B。分離培養(yǎng)鑒定按照6.1的方法制備成組織懸浮液后，用滅菌接種環(huán)蘸取懸浮液在NA培養(yǎng)基上劃線分離，28℃恒溫培養(yǎng)24h后開(kāi)始觀察，挑取可疑單菌落進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接2次～3次，隨后進(jìn)行致病性測(cè)定、BIOLOG鑒定、分子生物學(xué)鑒定。BIOLOG鑒定利用BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行鑒定，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。致病性測(cè)定如果有爭(zhēng)議或者有必要需按以下步驟對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。將待測(cè)菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h左右，用無(wú)菌水配成108CFU/mL左右的細(xì)菌懸浮液，用針刺法接種至健康蘭花苗葉片上28℃保濕培養(yǎng)，接種48h后開(kāi)始，每隔24h觀察，是否出現(xiàn)附錄A中所描述的癥狀。結(jié)果判定對(duì)于有典型癥狀植株樣品，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即判定為檢出蘭花細(xì)菌性褐腐病菌。無(wú)癥狀植株樣品，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，且分離培養(yǎng)鑒定或Biolog鑒定為陽(yáng)性，可判定檢出蘭花細(xì)菌性褐腐病菌。樣品及檢測(cè)結(jié)果保存樣品及菌種保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。對(duì)檢出蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的樣品應(yīng)保存于4℃冰箱中，以備復(fù)核。該類(lèi)樣品保存期滿(mǎn)后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。從檢測(cè)樣品中分離并鑒定為蘭花細(xì)菌性褐腐病菌的菌株，應(yīng)妥善保存?？刹捎酶视屠鋬霰４婊騼龈杀４?。對(duì)不需要長(zhǎng)期保存的菌株應(yīng)及時(shí)滅菌處理。結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)包括：樣品來(lái)源、種類(lèi)、時(shí)間，檢測(cè)時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有實(shí)驗(yàn)人員和審核人員的簽字?，F(xiàn)場(chǎng)檢疫發(fā)現(xiàn)的可疑癥狀、培養(yǎng)基上的菌落特征和人工接種的典型癥狀等應(yīng)及時(shí)拍照保存，PCR凝膠電泳檢測(cè)需有電泳結(jié)果照片。

（資料性附錄）

蘭花細(xì)菌性褐腐病菌相關(guān)資料癥狀病菌主要侵染植株或葉片，病菌若在葉片中部為害則形成卵圓形水淹狀黃色斑點(diǎn)，后轉(zhuǎn)褐色；若從葉生長(zhǎng)點(diǎn)侵入則地上部干縮枯死。感染初期在葉上出現(xiàn)軟的、水漬狀的小斑點(diǎn)，繼而發(fā)展成輪廓清晰的、褐色或黑色的凹陷斑點(diǎn)，淡褐色油浸狀，并擴(kuò)展到莖和生長(zhǎng)點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。在蝶蘭中，此斑點(diǎn)為水皰狀，擴(kuò)展并聯(lián)合成片，外圍具黃色或淺綠色的暈圈；在兜蘭中，則斑點(diǎn)呈水漬狀而柔軟。此病發(fā)展迅速，會(huì)使整個(gè)植株死亡。高溫高濕條件下易發(fā)病，相對(duì)濕度高于80%時(shí)，發(fā)病重。E.cypripedii在大花惠蘭葉片中部為害癥狀E.cypripedii接種蝴蝶蘭幼苗的為害癥狀地理分布南非、日本、X大利亞、美國(guó)、中國(guó)XX、韓國(guó)。寄主植物仙人指甲蘭（Aeridisjaponium）、杓蘭屬（Cypripediumspp.）、兜蘭屬（Paphiopedilum）、蝶蘭屬（phalaenopsis）和番木瓜（Caricapapaya）、大花蕙蘭（Cymbidium）等。病原菌形態(tài)及理化特征病原菌菌體桿狀，兩端鈍圓，大小為（0.5～1）μmx（1～3）μm，周生鞭毛。為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為27℃～30℃，37℃能生長(zhǎng)，氧化酶陰性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，能利用海藻糖、麥芽糖、蜜二糖、纖維二糖、不能從乳糖、棉子糖產(chǎn)酸，不能液化明膠，不產(chǎn)生吲哚，不產(chǎn)3-羥基丁酮。病原菌在NA培養(yǎng)基上單菌落表現(xiàn)為淡黃色、圓形、表面突起、邊緣整齊，光滑不透明。Erwinia屬內(nèi)在蘭花上引起腐爛癥狀的細(xì)菌共有三個(gè)近似種，分別是E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora，三個(gè)近似種的理化特征比較見(jiàn)表A.1。E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora三個(gè)種的理化特征比較測(cè)試項(xiàng)目Erwinia屬內(nèi)三個(gè)近似種E.cypripediiE.chrysanthemiE.carotovora革蘭氏染色（24h）吲哚產(chǎn)生-+-半固體X脂-++苯基丙氨酸脫氨酶（24h）+--明膠水解（22℃）-++己六醇乳糖-d+麥芽糖+-d棉子糖-++海藻糖+-+脂肪酶-+-接觸酶反應(yīng)（24h）+++-：0%～10%陽(yáng)性；d：26%～75%陽(yáng)性；+：90%～100%陽(yáng)性

（規(guī)范性附錄）

蘭花細(xì)菌性褐腐病菌PCR特異性擴(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)引物EcUP：5'-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3'EcNP：5'-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3'PCR反應(yīng)體系及條件25μLPCR反應(yīng)體系：2×PCR預(yù)混液12.5μL，引物10μmol/L各1μL，DNA模板2.0μL，補(bǔ)充超純水至25μL。PCR反應(yīng)條件：98℃/2min；98℃，10s；59.4℃，10s；72℃，10s，35個(gè)循環(huán)；延伸：72℃/3min；4℃保存。不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。X脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%X脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的DNA條帶，并拍攝記錄。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為420bp。結(jié)果判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%X脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)約420bp條帶、而陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果判定為陽(yáng)性；待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)420bp條帶，僅陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)420bp條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果判定為陰性。參?考?文?獻(xiàn)[1]任欣正.植物病原細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定[M].XX：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994.[2]Ma?gorzataWaleron，KrzysztofWaleron，AnnaJ.PodhajskaandEwa?ojkowska.GenotypingofbacteriabelongingtotheformerErwiniagenusbyPCR-RFLPanalysisofarecAgenefragment.PrintedinGreatBritain[J].Microbiology，2002，148:583–595.[3]S.Alab，T.Naglic，M.Tusek-Znidaric，M.Peterkac，M.RavnikaracandT.Dreoac*.PutativenewspeciesofthegenusDickeyaasmajorsoftrotpathogensinPhalaenopsisorchidproduction[J].PlantPathology，2017，66:1357–1368.[4]Cating，R.A