第五章克隆基因的表達(dá)

第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)當(dāng)前第1頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素當(dāng)前第2頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)1、基因表達(dá)的基本過程當(dāng)前第3頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)1、基因表達(dá)的基本過程基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，目的基因通過轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,transferRNA）將各種氨基酸運(yùn)送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。當(dāng)前第4頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素當(dāng)前第5頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)Transcription(轉(zhuǎn)錄):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

轉(zhuǎn)錄的具體過程當(dāng)前第6頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的具體過程Antisensestrand當(dāng)前第7頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Groupsofgenescodingforrelatedproteinsarearrangedinunitsknownasoperons.Anoperonconsistsofanoperator,promoter,regulator,andstructuralgenes.Theregulatorgenecodesforarepressorproteinthatbindstotheoperator,obstructingthepromoterofthestructuralgenes.Theregulatordoesnothavetobeadjacenttoothergenesintheoperon.Iftherepressorproteinisremoved,transcriptionmayoccur.半乳糖苷酶滲透酶轉(zhuǎn)乙酰基酶當(dāng)前第8頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)Operonsareeitherinducibleorrepressibleaccordingtothecontrolmechanism.Seventy-fivedifferentoperonscontrolling250structuralgeneshavebeenidentifiedforE.coli.Bothrepressionandinductionareexamplesofnegativecontrolsincetherepressorproteinsturnofftranscription.當(dāng)前第10頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)

啟動(dòng)子（promoter）：在基因序列中，標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始的可被RNA聚合酶識(shí)別的位點(diǎn)(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。

終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄停止的RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)。有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Prokaryoticgeneregulationdiffersfromeukaryoticregulation,butsinceprokaryotesaremucheasiertoworkwith,wefocusonprokaryotesatthispoint.

PromotersaresequencesofDNAthatarethestartsignalsforthetranscriptionofmRNA.Terminatorsarethestopsignals.mRNAmoleculesarelong(500-10,000nucleotides).

當(dāng)前第12頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素當(dāng)前第13頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)TheGeneticCodeTocodeforthe20essentialaminoacidsageneticcodemustconsistofatleasta3-baseset(triplet)ofthe4bases.Ifoneconsidersthepossibilitiesofarrangingfourthings3atatime(4X4X4),weget64possiblecodewords,orcodons(a3-basesequenceonthemRNAthatcodesforeitheraspecificaminoacidoracontrolword).ThegeneticcodewasbrokenbyMarshallNirenbergandHeinrichMatthaei,adecadeafterWatsonandCrick'swork.Thegeneticcodeconsistsof61amino-acidcodingcodonsandthreeterminationcodons,whichstoptheprocessoftranslation.Thegeneticcodeisthusredundant(degenerateinthesenseofhavingmultiplestatesamountingtothesamething),with,forexample,glycinecodedforbyGGU,GGC,GGA,andGGGcodons.正確翻譯的基本條件當(dāng)前第14頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)Thegeneticcode當(dāng)前第15頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)MessengerRNA(mRNA)istheblueprintforconstructionofaprotein.TransferRNA(tRNA)isthetruckdeliveringtheproperaminoacidtothesiteattherighttime.tRNAwillforma"cloverleaf"structureduetocomplementarybasepairing.Atthetopofthelargelooparethreebases,theanticodon,whichisthecomplementofthecodon.Thereare61differenttRNAs,eachhavingadifferentbindingsitefortheaminoacidandadifferentanticodon.當(dāng)前第16頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)Ribosomesaretheorganelle(inallcells)whereproteinsaresynthesized.Theyconsistoftwo-thirdsrRNAandone-thirdprotein.Ribosomesconsistofasmall(inE.coli,30S)andlarger(50S)subunits.ThelengthofrRNAdiffersin

each.The30Sunithas16SrRNAand21differentproteins.The50Ssubunitconsistsof5Sand23SrRNAand34differentproteins.ThesmallersubunithasabindingsiteforthemRNA.

ThelargersubunithastwobindingsitesfortRNA當(dāng)前第17頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)TranslationistheprocessofconvertingthemRNAcodonsequencesintoanaminoacidsequence.Theinitiatorcodon(AUG)codesfortheaminoacidN-formylmethionine(f-Met).NotranslationoccurswithouttheAUGcodon.f-Metisalwaysthefirstaminoacidinapolypeptidechain,althoughfrequentlyitisremovedaftertranslation.TheintitatortRNA/mRNA/smallribosomalunitiscalledtheinitiationcomplex.Thelargersubunitattachestotheinitiationcomplex.Aftertheinitiationphasethemessagegetslongerduringtheelongationphase.當(dāng)前第18頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)NewtRNAsbringtheiraminoacidstotheopenbindingsiteontheribosome/mRNAcomplex,formingapeptidebondbetweentheaminoacids.ThecomplexthenshiftsalongthemRNAtothenexttriplet,openingtheAsite.ThenewtRNAentersattheAsite.WhenthecodonintheAsiteisaterminationcodon,areleasingfactorbindstothesite,stoppingtranslationandreleasingtheribosomalcomplexandmRNA.Oftenmanyribosomeswillreadthesamemessage,astructureknownasapolysomeforms.Inthiswayacellmayrapidlymakemanyproteins.當(dāng)前第19頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框當(dāng)前第20頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)基因表達(dá)的基本過程當(dāng)前第21頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素當(dāng)前第22頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素一般而言，所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度、DNA的轉(zhuǎn)錄其始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會(huì)在一定程度上影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響大多數(shù)大腸桿菌啟動(dòng)子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄其始位點(diǎn)上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5’--TTGACA)和-35區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25bp處，一般有10bp組成，故稱為-35區(qū)，5’--TATAAT)。當(dāng)然，實(shí)際的啟動(dòng)子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動(dòng)子的這兩個(gè)區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動(dòng)子的表達(dá)能力也就越強(qiáng)。另外，這兩個(gè)保守區(qū)間的距離也是影響啟動(dòng)子強(qiáng)度的重要因素，即這個(gè)間距越是接近于17bp，啟動(dòng)子的活性就越強(qiáng)。當(dāng)前第23頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)b.翻譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響

mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結(jié)合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結(jié)合位點(diǎn)是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長(zhǎng)度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3‘端互補(bǔ)，控制了翻譯的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----16SrRNA3’末端當(dāng)前第24頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)c.啟動(dòng)子與克隆基因間的距離對(duì)基因表達(dá)的影響

研究表明啟動(dòng)子和目的基因間的距離對(duì)基因的表達(dá)效率影響很大，所以在構(gòu)建新的表達(dá)載體時(shí)要考慮到這儀因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序列，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量的大量消耗，或是形成不應(yīng)有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終影響的目的基因的表達(dá)效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA當(dāng)前第25頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)當(dāng)前第26頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建一、原核表達(dá)真核基因的困難二、構(gòu)建原核表達(dá)載體的策略三、常用于原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子當(dāng)前第27頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)一、原核表達(dá)真核基因的困難細(xì)菌的RNA聚合酶不識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子；真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，在原核細(xì)胞中不能結(jié)合到核糖體上；真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞沒有象真核細(xì)胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達(dá)出有功能的真核蛋白；表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中很不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解破壞。當(dāng)前第28頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)二、構(gòu)建原核表達(dá)載體的策略將真核基因克隆到一個(gè)強(qiáng)大的原核啟動(dòng)子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因，這樣就解決了原核細(xì)胞沒有RNA剪接功能的問題。構(gòu)建載體時(shí)，將真核基因插在幾個(gè)原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識(shí)別和降解，最后可以將融合多肽切除。當(dāng)前第29頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)三、常用于原核表達(dá)的啟動(dòng)子Lac啟動(dòng)子是β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動(dòng)子可以被IPTG誘導(dǎo)，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導(dǎo)物就可以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。Trp啟動(dòng)子是編碼參與色氨酸生物合成的幾種酶的基因簇的上游調(diào)控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被β-吲哚丙烯酸（β-

IAA）誘導(dǎo)。Tac啟動(dòng)子是一種由Lac和Trp啟動(dòng)子雜合而成的啟動(dòng)子，其強(qiáng)度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。λPL啟動(dòng)子是負(fù)責(zé)λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一，是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子。當(dāng)前第30頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)當(dāng)前第31頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)一、真核基因表達(dá)的特點(diǎn)二、用于植物表達(dá)的啟動(dòng)子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化當(dāng)前第32頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)真核基因表達(dá)的特點(diǎn)一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽，不存在象原核生物那樣的多基因操縱子模式；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)很大，而且往往遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾百個(gè)甚至上千個(gè)堿基，它們并不直接影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，而是通過改變基因5’上游區(qū)DNA的構(gòu)型來影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合；mRNA合成后穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中后才進(jìn)行翻譯工作，而且通常都有復(fù)雜的成熟和剪接過程；基因的啟動(dòng)子區(qū)和原核基因差異很大，而且有增強(qiáng)子序列存在。當(dāng)前第33頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的特點(diǎn)特點(diǎn)起始位點(diǎn)上游調(diào)控區(qū)其它調(diào)控區(qū)原核生物嘌呤和嘧啶都能起始轉(zhuǎn)錄范圍小，-10區(qū)，-30到-70區(qū)為正調(diào)控區(qū)，+10到-20區(qū)為負(fù)調(diào)控區(qū)；有TTGACA區(qū)(-30~-40）參與調(diào)控。真核生物有“帽子”結(jié)構(gòu)專一性（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（A為主）才能起始轉(zhuǎn)錄范圍大，TATAA/TA區(qū)位于-20到-30，-40到-110區(qū)為上游激活區(qū)；除了有對(duì)應(yīng)的CAAT區(qū)外，還有GC區(qū)和增強(qiáng)子。當(dāng)前第34頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負(fù)調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強(qiáng)子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核當(dāng)前第35頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)一、真核基因表達(dá)的特點(diǎn)二、用于植物表達(dá)的啟動(dòng)子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化當(dāng)前第36頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子類型天然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)誘導(dǎo)型表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)型調(diào)控體系組織特異型啟動(dòng)子組成型表達(dá)花椰采花葉病毒(CaMV)

35S啟動(dòng)子水稻肌動(dòng)蛋白1(actin1)act1啟動(dòng)子

當(dāng)前第37頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)表達(dá)組織啟動(dòng)子來源目的植物作者花藥煙草Ta29煙草油菜Mariani（1990）種子菜豆植物凝集素基因PHA-LtobaccoAltabella（1990）葉片PEPC（PepcarboxylaseGeneofMaize）maizeKozial（1993）韌皮部水稻蔗糖合酶基因RSs1tobaccoShi（1994）果實(shí)ovarytissue（patent）tomatoMartineau（1995）胚乳玉米淀粉合酶基因GBSmaizeRussell（1997）根系發(fā)根農(nóng)桿菌的rolD啟動(dòng)子番茄Varvara（2001）髓部玉米pGL2riceDatta（1998）部分用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的組織特異性啟動(dòng)子當(dāng)前第38頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)RSuS1啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)35S-GusRSP1/2-Gus當(dāng)前第39頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)

化學(xué)誘導(dǎo)型調(diào)控系統(tǒng)是指可被某些化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)而表達(dá)啟動(dòng)或表達(dá)關(guān)閉的轉(zhuǎn)基因調(diào)控系統(tǒng)。和植物天然的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，該類系統(tǒng)的應(yīng)用更加靈活和自由，人們可以根據(jù)需求在轉(zhuǎn)基因作物生長(zhǎng)的任何時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。作為理想的化學(xué)誘導(dǎo)物必須具備以下特性：第一，化學(xué)誘導(dǎo)物要對(duì)轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的專一性高，在受體作物中其本身含量低且對(duì)受體作物無毒害作用；第二，對(duì)環(huán)境友好，且造價(jià)不高；第三，誘導(dǎo)效率要高，其工作濃度低且不是常用的化學(xué)物質(zhì)；第四，方便于噴灑或蘸根處理。

化學(xué)誘導(dǎo)型表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的原理當(dāng)前第40頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)物的分子式Moleculesusedforthechemicalinductionoftransgeneexpressioninplants.TetracyclineDexamethasoneEthanolRH-5992當(dāng)前第41頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)化學(xué)誘導(dǎo)型表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的原理一般來說，化學(xué)誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)都包含兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元由一個(gè)組成型啟動(dòng)子（通常為35S啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)一個(gè)對(duì)特定化學(xué)成分敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)成；第二個(gè)轉(zhuǎn)錄單元由多拷貝的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、微型植物啟動(dòng)子（通常為截短的35S啟動(dòng)子）和目的基因串聯(lián)而成。當(dāng)前第42頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)A去抑制型B失活型當(dāng)前第43頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)一、真核基因表達(dá)的特點(diǎn)二、用于植物表達(dá)的啟動(dòng)子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化當(dāng)前第44頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國(guó)、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。1907年Smith和Townsent等首先發(fā)現(xiàn)這種冠癭瘤病是由根癌農(nóng)桿菌引發(fā)的。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化當(dāng)前第45頁\共有53頁\編于星期五\9點(diǎn)農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化1974年Zaenen等在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離了一種與腫瘤誘導(dǎo)有關(guān)的大型質(zhì)粒（大于200kb），稱為Ti質(zhì)粒。1977年Chilton等在研究農(nóng)桿菌侵染后形成的植物腫瘤細(xì)胞時(shí)，用分子雜交發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在著農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒