生產(chǎn)菌種的制備與保藏演示文稿

生產(chǎn)菌種的制備與保藏演示文稿2023/6/19本文檔共87頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分優(yōu)選生產(chǎn)菌種的制備與保藏本文檔共87頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19第五章生產(chǎn)菌種的制備與保藏2/jing/C76/zcr-1.htm第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏本文檔共87頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19種子擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產(chǎn)下游處理發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵工程的工藝流程廢棄物資源化、無害化產(chǎn)品課程導(dǎo)入本文檔共87頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室搖瓶-小試-中試5L小試5L-50L二級發(fā)酵裝置課程導(dǎo)入本文檔共87頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19本節(jié)課的重點(diǎn)和難點(diǎn)本節(jié)課的重點(diǎn)

1、種子制備過程2、種子質(zhì)量的控制措施

本節(jié)課的難點(diǎn)

影響種子質(zhì)量的因素本文檔共87頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念2菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)3種子制備的過程4發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)方法第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程返回請點(diǎn)我呀本文檔共87頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.1種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念

指保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入固體試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶或靜置培養(yǎng)，以及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得發(fā)酵產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量充足、不被雜菌和噬菌體污染的生產(chǎn)菌種的純種制備過程。該純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.1種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念

發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子必須滿足的條件1)菌體的純種培養(yǎng)物總量適宜，以保證在發(fā)酵罐中有適當(dāng)?shù)慕臃N量；2）微生物菌種的生命力旺盛，移接到發(fā)酵罐中后能夠迅速生長，利于縮短延滯期，提高設(shè)備的利用率；3）菌種能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，生理狀態(tài)穩(wěn)定；4）無雜菌和噬菌體的污染。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.2菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)

其任務(wù)：要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)?？股仡惍a(chǎn)品的生產(chǎn)采用放線菌，一般采用三級或四級種子擴(kuò)大培養(yǎng)；谷氨酸等氨基酸產(chǎn)品，以及部分酶制劑類產(chǎn)品生產(chǎn)，采用細(xì)菌，采用二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.3種子制備的過程(P118)砂土管孢子冷凍干燥孢子斜面培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段二級種子罐培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)生產(chǎn)車間種子制備階段（四級種子罐培養(yǎng)）發(fā)酵罐（三級種子罐培養(yǎng)）種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.3種子制備的過程一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備1）孢子的制備細(xì)胞孢子的制備：細(xì)胞的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，培養(yǎng)溫度一般為37℃，時間為1-2d，產(chǎn)芽胞的則需5-10d。霉菌孢子的制備：一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然產(chǎn)品為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度一般為25-28℃，時間為4-14d。放線菌孢子的制備：一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)溫度一般為28℃，時間為5-14d。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.3種子制備的過程一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備2）液體種子的制備好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種試管三角燒瓶搖床種子罐。厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌(啤酒、葡萄酒、清酒等）

試管三角燒瓶卡式罐種子罐。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19例：啤酒酵母(P120)4℃保存于麥芽瓊脂或MYPG培養(yǎng)基菌種10mL麥芽汁的500-1000mL三角瓶250-500mL麥芽汁的500-1000mL三角瓶5-10L麥芽汁的卡式罐

25℃，2-3d25℃，2d，定時搖動或通氣15-20℃，3-5d2/jing/C76/zcr-1.htm100L麥芽汁的發(fā)酵罐

本文檔共87頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.3種子制備的過程二、生產(chǎn)車間種子制備1）種子罐的作用

便孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌絲體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。2）種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，主要取決于兩方面：①菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；②所采用發(fā)酵罐的容積。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.3種子制備的過程2）種子罐級數(shù)的確定

細(xì)菌生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，如谷氨酸等氨基酸類產(chǎn)品以及部分酶制劑類產(chǎn)品可用2級發(fā)酵，即：茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐。

霉菌生長較慢，如青霉菌，可用3級發(fā)酵，即：孢子懸浮液→1級種子罐（27℃，40h孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→2級種子罐（27℃，10～24h，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐。

放線菌的細(xì)胞生長繁殖緩慢，如抗生素類產(chǎn)品，一般采用3級或4級種子擴(kuò)大培養(yǎng)。

酵母生長比細(xì)菌慢，比霉菌和放線菌快，通常用3級種子。如啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)一般第1級到第2級為8~10倍，第2級到第3級為4~6倍。

第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程二、生產(chǎn)車間種子制備本文檔共87頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19二、生產(chǎn)車間種子制備3）確定種子罐級數(shù)需注意的問題A：種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會。B：種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌的機(jī)會。C：雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定，但也與所選出用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191.4發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)方法

1）種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法：表面培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法（曲法培養(yǎng)）、液體深層培養(yǎng)法、載體培養(yǎng)法。

2）深層培養(yǎng)法的基本操作控制點(diǎn)：滅菌、溫度控制、通氣與攪拌。

3）常用的液體深層培養(yǎng)法：放大法、兩步法、控制培養(yǎng)法、分批培養(yǎng)法（間歇發(fā)酵法）、連續(xù)培養(yǎng)法（連續(xù)發(fā)酵法）、補(bǔ)料分批培養(yǎng)法（流加法）。第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程本文檔共87頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19第五章生產(chǎn)菌種的制備與保藏2/jing/C76/zcr-1.htm第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏本文檔共87頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191、種子質(zhì)量的判定（1）pH；（2）培養(yǎng)基滅菌后糖、氨基酸、磷等的含量；（3）顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液的外觀色澤和顆粒等；（4）其他參數(shù)，主要酶活力、產(chǎn)品含量等。第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證本文檔共87頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/192、影響種子質(zhì)量的因素(P121)2/jing/C76/zcr-1.htm（1）培養(yǎng)基（2）培養(yǎng)溫度和濕度（3）培養(yǎng)時間(種齡)（4）接種量（5）通氣和攪拌（6）泡沫（7）染菌的控制（8）種子罐級數(shù)第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證本文檔共87頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19種齡/h種齡與堿性蛋白酶活力之間的關(guān)系酶活力/（U/mL）接種量/%酶活力/（U/mL）

接種量對堿性蛋白酶產(chǎn)生的影響8121620136791000800600400140012001000800本文檔共87頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/193、種子異常的分析（1）菌種生長發(fā)育緩慢或過快（2）菌絲結(jié)團(tuán)（3）菌絲粘壁2/jing/C76/zcr-1.htm第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證本文檔共87頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/194、種子質(zhì)量的控制措施（1）菌種穩(wěn)定性的檢查

方法：將保藏菌株溶于無菌的生埋鹽水中，逐級稀釋，然后在培養(yǎng)皿瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出菌落，選擇形態(tài)優(yōu)良的菌落接入三角瓶進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，檢測出生產(chǎn)率高的菌種備用。這一分離方法適用于所有的保藏菌種，并且一年左右必須做一次。

（2）無雜菌檢查

在種子制備過程中，每移種一次都需要進(jìn)行雜菌檢查。方法：顯微鏡觀察，或平板培養(yǎng)試驗(yàn)，即將種子液涂在平板培養(yǎng)皿上劃線培養(yǎng)，觀察有無異常菌落，定時檢查，防止漏檢。此外，也可對種子液的生化特性進(jìn)行分析，如取樣測其營養(yǎng)消耗速度、pH變化、溶氧利用情況、色澤、氣味是否異常等。本文檔共87頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/195、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（1）細(xì)胞或菌體（菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀）單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)。霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。（2）生化指標(biāo)：種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化（3）產(chǎn)物生成量：在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。（4）酶活力：種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定關(guān)系。本文檔共87頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19第五章生產(chǎn)菌種的制備與保藏第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量保證第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏本文檔共87頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19第三節(jié)菌種保藏的原理和方法本文檔共87頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19提綱菌種保藏的目的和意義菌種保藏的原理和方法

斜面保藏法和穿刺保藏法

沙土管干燥保藏法

真空冷凍干燥保藏法

液氮保藏法

菌種復(fù)壯

種子擴(kuò)大培養(yǎng)本文檔共87頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19菌種保藏的目的和意義目的意義：保持優(yōu)良菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。優(yōu)良菌種丟失（退化）的原因：世代短、易變異、易污染、死亡。菌種保藏機(jī)構(gòu)：世界現(xiàn)有700多家專門機(jī)構(gòu)。措施：創(chuàng)造條件，使微生物處于休眠狀態(tài)，減少變異。

低營養(yǎng)、低溫、干燥、缺氧→低代謝、低生長本文檔共87頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19菌種保藏的原理和方法菌種保藏(Cultureconservation)原理挑選優(yōu)良的菌種，最好是休眠體創(chuàng)造有利于種子休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)）菌種保藏方法斜面(Slant)低溫保藏法 傳代培養(yǎng)，六個月砂土管保藏法 適用范圍廣，兩年冷凍干燥(Freez-drying)保藏法 長達(dá)十年液氮超低溫保藏法（-130℃）

(Liquidnitrogenultra-lowtemperaturestorage)

本文檔共87頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19一、斜面保藏法和穿刺保藏法1.斜面保藏法：（短期，3-6個月）范圍：細(xì)菌、放線菌、酵母、絲狀真菌方法：適宜培養(yǎng)基→適溫培養(yǎng)→冰箱保藏（4-5℃）→到期轉(zhuǎn)種優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備、方法簡單缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)代多，易變異；污染機(jī)會多本文檔共87頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19一、斜面保藏法和穿刺保藏法2.穿刺保藏法：（好氣菌，6-12個月）方法：小試管或螺口管→1﹪瓊脂培養(yǎng)基→接種針穿刺→培養(yǎng)→蓋2-3mm無菌液體石蠟

→冰箱保藏范圍：細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌優(yōu)點(diǎn)：范圍較廣，簡便實(shí)用缺點(diǎn)：不適用能利用石蠟為碳源的微生物；不同種類，保藏期差異較大。本文檔共87頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19二、沙土管干燥保藏法范圍：產(chǎn)孢子的放線菌和絲狀真菌，形成芽孢的細(xì)菌。方法：沙、土分別洗凈→烘干、過篩（80-100目）→

1-2︰1沙土混合、裝管1cm→121℃滅菌2-3次→無菌檢驗(yàn)→烘干備用→孢子或懸液與沙土混勻→真空抽干→封口（熔封、石蠟封）→干燥器中于冰箱5℃保藏特點(diǎn)：設(shè)備簡單，方法較繁，效果較好（長，2

年，有長達(dá)10年），但范圍受限制。本文檔共87頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19三、真空冷凍干燥保藏法方法：

1.安瓶管處理：8-10×100-150mm，浸洗、烘干、

蓋口；滅菌、干燥（60℃）。2.保護(hù)劑：減少冷凍干燥對微生物的損傷，常用脫脂牛奶、血清（適當(dāng)方法滅菌）。

3.菌懸液制備：斜面→加保護(hù)劑→制懸液→吸入安管

4.冷凍干燥：快冷至-15--30℃，抽真空，15分鐘內(nèi)達(dá)到66.661Pa；升到13.3322Pa，升溫至20-30℃；真空封口。5.安瓶管保藏：4-5℃，5-10年。（樣品含水量1-3％）本文檔共87頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19四、液氮保藏法方法：

①濃菌懸液→加保護(hù)劑→裝安管0.2-1cm→封口

②降溫（1℃/min）至-25℃，入液氮罐，-150—-196℃保藏。③取出時，應(yīng)于溫水（38-40℃）中震蕩1-2min。特點(diǎn)：

效果好（2-3年，長達(dá)9年），方法簡單，

保藏對象廣泛。本文檔共87頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19五、菌種復(fù)壯1、純種的分離2、淘汰衰退的個體3、選擇合適的培養(yǎng)個體本文檔共87頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19六、國內(nèi)外主要菌種保存機(jī)構(gòu)介紹

ACCC中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心ISF中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所SH上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所CACC抗菌素菌種保藏管理中心IA中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工業(yè)研究所CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心AS中國科學(xué)院微生物研究所AS-IV中國科學(xué)院武漢病毒研究所CFCC林業(yè)微生物菌種保藏管理中心-------------------------國內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)名稱與縮寫本文檔共87頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19國外

ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技術(shù)評價研究所生物資源中心NBRC（IFO）是由日本經(jīng)濟(jì)部、商業(yè)部、工業(yè)部支持的半政府性質(zhì)菌種保藏中心。主要從事農(nóng)業(yè)、應(yīng)用微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護(hù)、工業(yè)微生物、普通微生物、分子生物學(xué)等的研究。該中心保藏有細(xì)菌1446株，真菌568株，酵母164株。這些菌種主要來自本國的其它菌種保藏中心。該中心保藏的菌種可出售。

NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心本文檔共87頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19本節(jié)課小結(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子制備的過程發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)方法種子質(zhì)量的控制實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)生產(chǎn)車間種子培養(yǎng)影響種子質(zhì)量的影響種子異常表現(xiàn)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)種子質(zhì)量的控制措施本文檔共87頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19

本節(jié)課學(xué)習(xí)了發(fā)酵工業(yè)種子的制備及種子質(zhì)量的控制和菌種的保存，下節(jié)課將講授發(fā)酵過程中的供氧。下節(jié)課講授內(nèi)容本文檔共87頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/191．什么是種子的擴(kuò)大培養(yǎng)？種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)是什么？2．簡述種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的和意義。3．發(fā)酵工業(yè)對種子的要求有哪些？4．在菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)中，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？5．簡述種子制備的方式及其過程。6．影響種子質(zhì)量的因素有哪些？如何控制種子質(zhì)量？7.菌種保存的目的和原理是什么？主要有那些保存方法？本節(jié)課思考題本文檔共87頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19繼續(xù)學(xué)習(xí)的參考書及網(wǎng)站1李玉英.發(fā)酵工程[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2009.2李艷.發(fā)酵工程原理及技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2008.3羅大珍,林稚蘭.現(xiàn)代微生物發(fā)酵及技術(shù)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,2006.4劉振宇.發(fā)酵工程技術(shù)與實(shí)踐[M].上海:華東理工大學(xué)出版社,2007.5陳洪章.生物過程工程與設(shè)備[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003./本文檔共87頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2023/6/19Mayyousuccess!本文檔共87頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分本文檔共87頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。本文檔共87頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分作為種子的準(zhǔn)則菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。種子擴(kuò)培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平本文檔共87頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3.1種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：實(shí)驗(yàn)室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段

本文檔共87頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式對于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法(通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。本文檔共87頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分（一）孢子的制備1、細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5~10天。本文檔共87頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28?C。培養(yǎng)時間一般為4~14天。本文檔共87頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。本文檔共87頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：

對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。

試管→三角瓶→搖床→種子罐本文檔共87頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）

試管→三角瓶→卡式罐→種子罐本文檔共87頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分二、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。本文檔共87頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分1、種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。本文檔共87頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。種子罐級數(shù)取決于：菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量（種子液體積/培養(yǎng)液體積）以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。本文檔共87頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。

茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵

孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子（二級發(fā)酵）。本文檔共87頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。

本文檔共87頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3.2種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間和冷藏時間本文檔共87頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分1、培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機(jī)離子含量不同，如微量元素Mg2+

、Cu2+

、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。本文檔共87頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。本文檔共87頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分措施培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源本文檔共87頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、培養(yǎng)條件（1）溫度

溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。本文檔共87頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分（2）濕度

制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對濕度在40%~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。本文檔共87頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。本文檔共87頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。本文檔共87頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分4、接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。本文檔共87頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量本文檔共87頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分1、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。本文檔共87頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量（3）pH

本文檔共87頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3、種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來確定。Ru嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。本文檔共87頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分4、接種量接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時20~25%本文檔共87頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。菌種穩(wěn)定性的檢查無雜菌檢查本文檔共87頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、形態(tài)單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。本文檔共87頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分2、生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。本文檔共87頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分3、產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。本文檔共87頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分4、酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。本文檔共87頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢菌絲結(jié)團(tuán)菌絲粘壁本文檔共87頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏的意義

菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。本文檔共87頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分二、菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。本文檔共87頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分

菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A斜面冰箱保藏法（酵母）斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。B石蠟油封存法（酵母）向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。三、菌種保藏的方法本文檔共87頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\12點(diǎn)58分C沙土管保藏法（細(xì)菌，霉菌，防線菌）

這是國內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。它的制備方法是：

首先，將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為l－2∶l混合均勻，分裝于小試管中，裝料高